Name: a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells
Uploaded: 2014-04-11T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells at JoVE.com

Мы благодарны доктору Стивену Робинсон и г-жи Хании Czerwinska (Monash University) за щедрую поставку астроцитов культур.

1. Определите внутриклеточных аскорбиновая кислота в культивируемых клетках <ol><li> Клеточная культура и сбор урожая <ol><li> Расти суспензии (например эритролейкемии человека, К562) или прилипшие клетки (например, первичные астроциты) с использованием стандартных процед?...

<ol>
	<li>Buettner, G. R., Schafer, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albert+Szent-Gy&#246;rgyi:+vitamin+C+identification.">Albert Szent-Gy&#246;rgyi: vitamin C identification.</a> Biochem. J. , (2006).</li><li>Padayatty, S. J., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+physiology+and+pharmacology+of+vitamin.">New insights into the physiology and pharmacology of vitamin.</a> C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).</li><li>Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+dependence+of+the+hypoxia-inducible+factor+hydroxylases+(factor+inhibiting+HIF+and+prolyl+hydroxylase+domain+2)+on+ascorbate+and+other+reducing+agents.">Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents.</a> Biochem. J. 427, 135-142 (2010).</li><li>Manning, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+Promotes+Maturation+of+T-Cells.">Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).</li><li>Asard, H., et al., Banerjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Redox Biochemistry. , 22-37 (2007).</li><li>Aguirre, R., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+vascular+bed:+Importance+of+vitamin.">Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin.</a> C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).</li><li>May, J. M., Qu, Z. -. c., Mendiratta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+and+recycling+of+a-tocopherol+in+human+erythrocytes+by+intracellular+ascorbic+acid.">Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid.</a> Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).</li><li>Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+some+major+functions+of+vitamin+C+in+animals.">Synthesis and some major functions of vitamin C in animals.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).</li><li>Rumsey, S. C., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+transport+and+disposition+of+ascorbic+acid+in+humans.">Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans.</a> J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).</li><li>Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+chromosomal+mapping+of+the+human+nonfunctional+gene+for+L-gulono-g-lactone+oxidase,+the+enzyme+for+L-ascorbic+acid+biosynthesis+missing+in+man.">Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man.</a> J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).</li><li>Challem, J. J., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses,+ascorbate,+mutations,+in+the+evolution+of+Homo+sapiens.">Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens.</a> Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).</li><li>Nishikimi, M., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+the+deficiency+in+humans+of+gulonolactone+oxidase,+a+key+enzyme+for+ascorbic+acid+biosynthesis.">Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis.</a> Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).</li><li>Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. i. t. a. m. i. n. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=recycling+and+degradation+in+mammals.">recycling and degradation in mammals.</a> FEBS J. 274, 1-22 (2007).</li><li>May, J. M., Qu, Z. -. c., Qiao, H., Koury, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+loss+of+the+vitamin+C+transporter+in+erythrocytes.">Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).</li><li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vitamin+C+transport.">Regulation of vitamin C transport.</a> Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).</li><li>Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pecking+order+of+free+radicals+and+antioxidants:+lipid+peroxidation,+a-tocopherol,+and+ascorbate.">The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).</li><li>May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+ascorbic+acid+an+antioxidant+for+the+plasma+membrane.">Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane.</a> FASEB J. 13, 995-1006 (1999).</li><li>Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+-+important+for+iron+metabolism.">Ascorbic acid - important for iron metabolism.</a> Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transferrin+iron+reduction+and+uptake+are+regulated+by+transmembrane+ascorbate+cycling+in+K562+cells).">Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells).</a> J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+routes+of+iron+accumulation+in+astrocytes:+ascorbate-dependent+ferrous+iron+uptake+via+the+divalent+metal+transporter+(DMT1)+plus+an+independent+route+for+ferric+iron.">Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron.</a> Biochem. J. 432, 123-132 (2010).</li><li>Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+iron+uptake+is+stimulated+by+ascorbate+via+an+intracellular+reductive+mechanism.">Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).</li><li>Lawen, A., Lane, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+iron+homeostasis+in+health+and+disease:+uptake,+storage,+transport,+and+molecular+mechanisms+of+action.">Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action.</a> Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+in+the+brain.">Ascorbic acid in the brain.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).</li><li>Harrison, F. E., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+function+in+the+brain:+vital+role+of+the+ascorbate+transporter+SVCT2.">Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2.</a> Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).</li><li>Rebec, G. V., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vitamin+as+neuromodulator:+ascorbate+release+into+the+extracellular+fluid+of+the+brain+regulates+dopaminergic+and+glutamatergic+transmission.">A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission.</a> Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).</li><li>Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+view+at+C.">New view at C.</a> Nat. Med. 8, 445-446 (2002).</li><li>Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid:+Chemistry,+biology+and+the+treatment+of+cancer.">Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).</li><li>Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+stimulates+ascorbate+transport+by+astrocytes.">Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes.</a> Brain Res. 858, 61-66 (2000).</li><li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+uptake.">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li><li>May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -. c. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+transport+and+recycling+by+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells:+response+to+glutamate+toxicity.">Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity.</a> Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+regulation+and+its+neuroprotective+role+in+the+brain.">Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain.</a> Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutamate+aspartate+transporter+(GLAST)+mediates+L-glutamate-stimulated+ascorbate-release+via+swelling-activated+anion+channels+in+cultured+neonatal+rodent+astrocytes.">The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes.</a> Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+and+plasma+membrane+electron+transport+-+enzymes+vs+efflux.">Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).</li><li>Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume-sensitive+organic+osmolyte/anion+channels+in+cancer:+novel+approaches+to+studying+channel+modulation+employing+proteomics+technologies.">Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).</li><li>Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+methods+for+simultaneous+determination+of+ascorbic+and+dehydroascorbic+acids.">HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids.</a> Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).</li><li>Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+assay+for+ascorbate+using+a+plate+reader.">A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader.</a> Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+colorimetric+microplate+ferrocyanide+assay+applied+to+ascorbate-stimulated+transplasma+membrane+ferricyanide+reduction+and+mitochondrial+succinate+oxidation.">A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation.</a> Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Na+/H++exchangers+and+intracellular+pH+in+regulating+vitamin+C-driven+electron+transport+across+the+plasma+membrane.">A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane.</a> Biochem. J. 428, 191-200 (2010).</li><li>Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+for+transport+and+efflux+of+ascorbate+and+dehydroascorbate.">Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).</li><li>Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances.">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li><li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay.">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors.">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li><li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes.">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li><li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol.">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li><li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide.">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li></ol>

В этой статье мы представляем два быстрых, конкретных и относительно чувствительных колориметрических микропланшета тесты для определения аскорбиновой кислоты, полученной из внутри-и внеклеточных отсеков в культивируемых клетках. Анализы могут комплектоваться доступа к стандартны...

Открытие химической природы аскорбиновой кислоты (витамин С), и его идентификации в качестве долгожданного &quot;антицинготными фактора», Альберт Сент-Дьерди и другие в статьях, опубликованных с 1928 по 1934 1 были знаковые события в истории биохимии. В самом деле, эти открытия способствовали Сент-Дьерди присуждением Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1937 году. Постоянно расширяющийся набор ролей для аскорбиновой кислоты в животных и физиологии растений, а также на здоровье человека, по-прежнему являются субъекты активная научная Расследование и споры. L-аскорбат является обильное физиологический восстановитель и кофактор фермента в системах млекопитающих, и вносит свой ​​вклад в многочисленных хорошо определенных ферментативных реакций с участием коллагена гидроксилирование, карнитин и норадреналина биосинтез, метаболизм и тирозина пептидного гормона, амидирование 2. Интересно, монтаж evideNCE предполагает, что аскорбат играет важную роль в стимулировании других железа зависит от диоксигеназ, такие как пролил и аспарагинила гидроксилазы, вовлеченных в гидроксилирование и ориентации из гипоксии-индуцируемых факторов (ОПО) 1α 2α и 3. В недавнем докладе о том, что аскорбиновая кислота играет важную роль в Т-клеточной созревания до влияние хроматина деметилирования через его деятельности в стимулировании ядерных гидроксилаз, Jumonji C (JmjC) белки домена; последний из которых, кажется, требуют аскорбат для полноценной деятельности 4. Действительно, стимуляция таких ферментов по аскорбат-видимому, происходит такой же механизм для стимуляции аскорбата из HIF и коллагеновых гидроксилазы. Среди других классических эффектов, аскорбат вносит значительный вклад в клеточной антиоксидантной качестве водорастворимого цепи разорвать акцептора радикалов 5 и утилизации плазматической мембраны α-токоферол (витамин Е) через снижению α-tocopheroxyl радикал 6, шHICH играет важную роль в защите от перекисного окисления липидов мембраны 7. Важно отметить, что хотя большинство млекопитающих способны процессов нового печени синтеза аскорбиновой кислоты из D-глюкозы, высшие приматы, морские свинки и некоторые летучие мыши зависит от пищевых источников витамина 8. Это связано с инактивации гена Gulo, то ортологи которых в незатронутых млекопитающих кодирует фермент, γ-лактон gulono-оксидазы 9-13. Этот фермент необходим для окончательного реакции в аскорбат биосинтеза глюкозы из 13. После транспортера-опосредованной всасывания из просвета кишечника в организме человека, аскорбиновая кислота распространяется по всему телу по кровеносной системе. Витамин обычно можно найти в восстановленной форме в миллимолярных концентрации внутри клеток (с исключением эритроцитов, в которых концентрации обычно похож на преобладающей концентрации в плазме), и в микромолярном концentrations (например 50-200 мкМ) в большинстве внеклеточных жидкостях 14,15. В физиологических условиях, аскорбиновая кислота обычно претерпевает обратимое одноэлектронную окисление в аскорбил свободных радикалов (AFR, также известный как monodehydroascorbate или semidehydroascorbate). В то время как AFR является относительно стабильный радикал 16, в отсутствие его быстрого одноэлектронного снижению ферментативной обратно в аскорбат, два AFRs может дополнительно dismutate одному аскорбата и один дегидроаскорбат (DHA) 9,13,17. В внутрь клетки, окисление продукта двухэлектронного аскорбата, DHA, могут быть быстро снижается обратно в аскорбат на глутатион-и NAD (P) H-зависимой ферментной и не ферментативных реакций 13. В то время как в классическом принято считать, что только значительную роль аскорбиновой кислоты в метаболизме железа является стимулирование диетическое всасывание не тема железа 18, мы и другие предоставили доказательств сtrongly предполагая, что аскорбат играет значительно более значительную роль в метаболизме этого металла. Во-первых, аскорбат, который высвобождается аскорбата-изобилует клеток по-видимому, играют важную роль в модуляции поглощения не-трансферрином железа связаны клетками 19,20, и совсем недавно данные показывают, что аскорбиновая кислота также модулирует поглощение трансферрином железа неизбежно 21 клетками, последний из которых соответствует основным физиологическим захватывающие железо маршрута 22. Аскорбат необходим для нормального центральной нервной системной функции у млекопитающих 23,24. Вместе с коры надпочечников, гипофиза, вилочковой, сетчатки и желтого тела, мозг содержит высокие концентрации аскорбата по отношению к другим тканям организма 23,25-27. Кроме того, воздействие как астроциты 28,29 и нейроноподобных элементов 30 на глутамат, как известно, вызывают высвобождение аскорбата во внеклеточное пространство, где ascorbatе, как полагают, чтобы помочь защитить нейроны против индуцированной глутаматом нейронов дисфункции 31. В то время как точный механизм глутамат-индуцированный аскорбат выхода из астроцитов неизвестно, недавно мы представили доказательства, указывающий участие клетки опухоль, вызванная захвата глутамата на астроцитов глутамата и аспартата транспортера (GLAST, также известный возбуждающих аминокислот транспортер изоформы 1 [EAAT1 ] у людей) и, как следствие активация объема чувствительных осмолита и анионных каналов (VSOACs), которые проницаемы для малых органических анионов, таких как аскорбиновая кислота 32. Молекулярные тождества плазменных мембранных каналов, участвующих в образовании VSOAC остаются должны быть определены 33,34. Хотя многие тесты были разработаны для определения аскорбиновой кислоты в биологических образцах, которые включают в спектрофотометрических, флуорометрические и хроматографические анализы 35,36, есть много изменчивость в специфичности, чувствительности, interferencэ на химических загрязнителей, эффективного линейного диапазона и стабильности аналита конечной точки. Кроме того, другие важные факторы, влияющие на выбор анализа являются быстрота, простота в использовании и доступ к относительно специализированного оборудования, таких как жидкостной хроматографии высокоэффективной (ВЭЖХ) аппарата. Здесь мы приводим простой и очень специфический колориметрический микропланшет-анализ для определения внутриклеточного аскорбата в культивируемых клетках, а также в качестве отдельного анализа для определения аскорбат-отток из культивируемых клеток. Последний анализ направлен на обойти проблему недооценки аскорбат освобождение от клеток из-за быстрого обратного захвата высвобожденного аскорбата по транспортеров аскорбата натрия (в зависимости от SVCTs). Хотя оба этих метода появились в некоторых из наших предыдущих публикаций 19,20,32,37,38, эта рукопись обеспечивает явное набор инструкций и руководящих принципов для их эффективного выполнения.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Nunc 96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:135px;">Thermo</td>
			<td style="width:127px;">269620</td>
			<td style="width:132px;">Any flat-bottom 96-well plate can be used</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:284px;">Refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5415D</td>
			<td style="width:132px;">A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:74px;width:284px;">Refrigerated bench-top centrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5810R</td>
			<td style="width:132px;">Swing-bucket</td>
		</tr>
		<tr height="260">
			<td height="260" style="height:260px;width:284px;">Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer</td>
			<td style="width:135px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:284px;">Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">General-purpose buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:284px;">MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:284px;">HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2&#8226;2 H2O, 0.8 mM MgSO4&#8226;7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">General chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Highest purity preparations should be obtained</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30790</td>
			<td style="width:132px;">Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">C6762</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions prepared in DMSO or ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Ascorbate oxidase (AO)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A0157</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Potassium ferricyanide (FIC)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">455989</td>
			<td style="width:132px;">Trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&#8242;,5&#8242;&#8242;-disulfonic acid disodium salt)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">92940</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Sodium L-glutamate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Saponin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">47036</td>
			<td style="width:132px;">Prepare a 0.1% stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">3 M sodium acetate (pH 6.0)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.2 M citric acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">30 mM ferene-S</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stock solutions for ascorbate-efflux assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">AO (120 U/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">2.4 mM ferene-S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells

Витамин С (аскорбиновая кислота) играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только приходят на свет в последние годы. Например, в головном мозге, аскорбиновая кислота действует в нейропротективного и нейромодуляторного образом, что включает в себя аскорбат велосипеде между нейронами и вицинальных астроцитов - отношения, которые, как представляется, решающее значение для мозга аскорбат гомеостаза. Кроме того, новые данные наводит на мысль, что аскорбиновая кислота имеет значительно расширенную роль в регуляции клеточного и системного метаболизма железа, чем в классическом признается. Растущее признание интегральной роли аскорбиновой кислоты в нормальной и разрегулированной клеточном и организменном физиологии требует ряд средне-пропускной и высокочувствительных аналитических методов, которые могут быть выполнены без необходимости сильно дорогой специального оборудования. Здесь мы предлагаем четкие инструкции для средней пропускной, конкретные и относительно недорогой микропланшетного анализ для определения бой внутри-и внеклеточной аскорбиновая кислота в клеточной культуре.

Определение внутриклеточного аскорбат в культуре клеток суспензии В первом тесте (рис. 1), внутриклеточный аскорбат определяется после аскорбат конкретным (т.е. АО-чувствительных) уменьшение феррицианида чтобы ферроцианид, используя высокочувствительный о...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells at JoVE.com

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Быстрое и Удельный Микропланшетный Анализ для определения внутри-и внеклеточной аскорбат в культивируемых клетках

Аскорбат играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только вышли на свет в последние годы. Здесь мы опишем средне-пропускную способность, конкретное и недорогой микропланшетного анализ для определения как внутри-и внеклеточной аскорбиновой кислоты в клеточной культуре.

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Подсчет голосов и определение жизнеспособности культивируемых клеток

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Клоногенных Пробирной: прилипшие клетки

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Выделение и функциональный анализ митохондрий из культивируемых клеток и мышь ткани

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Обнаружение внутриклеточных экспрессии генов в живых клетках мышиных, человеческого и свиного происхождения с помощью флуоресцентной меченных наночастиц

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Быстрой, масштабируемый способ выделения, функционального исследования и анализа клеточного происхождения внеклеточной матрицы

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Кратковременная экспрессия и клеточная локализация рекомбинантных белков в культивируемых клетках насекомых

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Co Иммунопреципитация Assay с использованием эндогенного ядерных белков из клетки культивировали в гипоксических условиях

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...