Name: a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress
Uploaded: 2014-03-21T15:30:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress at JoVE.com

SS er finansieret af en Wellcome Trust Intermediate Klinisk Fellowship, CW med en Wellcome Trust program Grant.

1.. Mikroobjektglas Forberedelse <ol><li> Precoat en seks kanal mikroobjektglas med rotte hale collagen type I (RTC, fortyndet i PBS 1:100 giver en brugsfortynding på 220 ug / ml). Dette udføres ved at injicere 30 pi fortyndet RTC opløsning direkte ind i kanalerne og inkubere i 2 timer ved 37 ° C efterfulgt af tre gange vask med PBS. </li></ol> 2. Seeding Celler i Microslides <ol><li> Dissociér en sammenflydende T75 kolbe af dyrkede humane hepatiske sinusformede endotelceller (Hsec) (isoleret fra levervæv som tidligere beskrevet 13) trypsin-EDTA, vaskes i PBS og resuspenderes ved 3 x 10 6 celler / ml i komplette medier (human endotel basale medier suppleret med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100μg/ml streptomycin, 10% varmeinaktiveret AB humant serum, 10 ng / ml vaskulær endotelvækstfaktor og 10 ng / ml hepatocytvækstfaktor). Injicer 30 pi cellesuspension alvorligectly i hver kanal. </li><li> Lad celler at adhærere i 1 time i en befugtet inkubator ved 37 ° C med en 5% CO2-atmosfære på et dias rack. Efter at have ladet celler til at klæbe position portene på begge sider af hver kanal med komplet medium (figur 1). </li></ol> 3. Cytokinstimulering Celler <ol><li> Lad celler i inkubator i 24 timer. Vurdere cellevækst ved hjælp af et inverteret fasekontrastmikroskop. 24 timer før adhæsionsassayet, stimulere endotel monolag med cytokin ved at erstatte vækstmediet med komplet medium suppleret med tumornekrosefaktor alfa og interferon-gamma, både ved 10 ng / ml. </li></ol> 4.. Isolering af perifere blod-lymfocytter <ol><li> Isolere perifere blodlymfocytter fra fuldblod ved indledningsvis oprensning af mononukleare fraktion ved densitetsgradientcentrifugering over en passende celleseparation centrifugering medier i 25 minutter ved 800x g. Inkubér cellerne på plast til 1 time for at tillade adhærens af monocytter. </li><li> Efter tilslutning til plast aspirat lymfocyt beriget supernatant. Vask lymfocytterne og resuspender dem (typisk 1 x 10 6 celler / ml i strømningsmediet (endotel basale medier indeholdende 0,1% (v / v) bovint serum albumin (BSA)). </li></ol> 5.. Forbehandling af Endothelium eller Leukocytter med inhibitorer <ol><li> Forbered anbefalede fortyndinger af funktion blokerende antistoffer eller inhibitorer med små molekyler i endothelial media/0.1% (v / v) BSA. Udskift komplet medium med blokerende antistof / inhibitor opløsning i valgte mikroobjektglas kanal 30 minutter før flow assay. </li><li> Hvor der er planlagt forbehandling af kemokinreceptorer på lymfocytter, resuspenderes isolerede leukocytter i RPMI opløsning indeholdende 0,1% (v / v) BSA og inkuberes med 200 ng / ml Pertussis Toxin at blokere G-protein-koblet receptor aktivitet kemokinreceptorer alternativt fortyndes specifikke funktionblokerende antistoffer eller inhibitorer med små molekyler af kemokinreceptorer på anbefalede fortynding. Inkuber leukocytter ved 37 ° C i 30 minutter, derefter vaskes og resuspenderes i strømningsmediet. </li></ol> 6.. Opsætning af Flow Assay System <ol><li> Forvarm en termostatstyret transparent kammer til 37 ° C. Kammeret skal har åbninger til indføring af siliconerør og elektronisk levering til en elektronisk magnetventil, der muliggør skift mellem celler og medie med stort set ingen døde volumen. Kammeret er monteret på et inverteret mikroskop til at tillade fasekontrastmikroskopi. Figur 2 viser strømmen assaykammeret og mikroskop og mikroobjektglas anbringes på objektbordet. </li><li> Prefill en 50 ml glassprøjte med en luer lås med 10 ml sterilt destilleret vand og vedlægge en længde på 25 cm silikoneslange til sprøjten port. Indsætte i en sprøjtepumpe. Alter tilbagetrækning sats af sprøjten pumpen i henhold tilden mikroobjektglas producentens anvisninger for at opretholde en forskydningsspænding på 0,05 Pa (0,5 dyn / cm 2, figur 3). </li><li> Tag to 5 ml sprøjter, kasseres stemplerne og vedhæfte tønder til de to in-flow havne et elektronisk magnetventil hjælp silikoneslanger. <ol><li> Vedhæft 12 cm af silikone slange til out-flow ventil. Ventilen tillader vekslen mellem en cellefri vaskebuffer (endotel media/0.1% (v / v) BSA) og lymfocytsuspensionen. </li><li> Skyl elektronisk magnetventil ved at indsætte vaskebuffer i begge sprøjtecylindrene og sikre puffer strømmer fra en tønde gennem ventilen og ind outflow silikoneslanger. </li><li> Brug ventilen kontakten for at skifte til den anden cylinder og sikre buffer flyder, og at alle bobler fjernes fra systemet. Fjern vaskepuffer fra en af tønder og erstatte med lymfocytsuspension figur 4a. </li></ol></li><li> Tilslut silicone Tubing fra sprøjten pumpe til en havn i en udvalgt mikroobjektglas kanal via en mikroobjektglas adapter. Tilslut derefter silikoneslanger fra udstrømning ventilen til den modsatte port via en mikroobjektglas adapter. Sørg for, at silikoneslanger og adapterne er fyldt med vaskebuffer før tilslutning til at forhindre luftbobler ind i systemet (figur 4b). </li><li> Når den er tilsluttet til strømmen, skal du placere mikroobjektglas på mikroskopbordet og vedhæfte med clips eller tape for at forhindre bevægelse. Indstil mikroskopet 10X mål sammen med passende fase indstilling. Sørg endotelmonolaget visualiseres og i fokus ved hjælp af okular linsen. Sikre billeder kan opfanges via et kamera, der er knyttet til mikroskopet, hvorved billederne kan videresendes til en skærm og registreres. </li></ol> 7.. Flow Assay Teknik og Registrering af klæbeevne til analyse <ol><li> Perfuse endothellaget med vaskebuffer i 2 min ved påbegyndelse withdrawal sprøjtepumpen for at fjerne snavs eller ubundne blokerende antistof og derefter skifte ventilen for at tillade en 5 min bolus af leucocyt-opløsning ved en konstant mur forskydningsspænding på 0,05 Pa </li><li> Under den sidste 2 min af leukocyt bolus, optage 10 tilfældige felter langs længden af ​​mikroobjektglas. Dette tillader offline analyse af lymfocyt rullende / tethering på endotelmonolaget. Optag hvert felt i ca 10 sek, før du flytter til den næste og sikre, at optagelserne er lavet imod flowretningen at undgå at optage den samme rullende celle to gange hurtigt efter hinanden. </li><li> Følg leukocyt bolus med en 5 min bolus vaskebuffer ved at returnere ventilen til sin startposition. De sidste 2 minutter af denne bolus foretage en anden optagelse fase ved at vælge mindst 10 tilfældigt udvalgte felter langs længden af ​​mikroobjektglas. Optag hvert felt i ca 5 sek, før du flytter til den næste, og sikre, at den endotelmonolaget og vedhængende leucocytes er i klar fokus. Dette giver mulighed for offline analyse af mønstret af friktion. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser

Det mest kritiske trin for en vellykket udførelse af en flow-assay er at sikre, at sunde og sammenflydende monolag af endotelceller er parat før strømmen adhæsionsassayet. Primære endotelceller kan være vanskelige at dyrke og følsom over for ændringer i dyrkningsmetoder. Det er vigtigt, at 1) strømningskamre tilstrækkeligt og ensartet overtrukket med endothelceller i et monolag, for Hsec vi bruger rotte hale collagen type I, men dette kan variere for andre endotheliale populationer, 2) dyrkningsmedium er passende for celletypen for Hsec vi har beskrevet vores komplette medium i protokollen afsnit. Andre vigtige skridt omfatter indstilling sprøjtepumpen på den relevante sats for at afspejle fysiologiske niveauer af forskydningsspænding. I flow-analysen er det nødvendigt at forhindre luftbobler i strømningskredsløbet, som kan beskadige endotelmonolaget eller strimler immunceller fra endoteloverfladen. Dette kan forhindres ved ensuring at alle silikoneslanger og adaptere perfunderet med vaskebuffer før forbindelse, at alle luftbobler er fjernet, og at medierne er forvarmet før brug. Ved tilslutning adapterne til portene på mikroobjektglas er det meget vigtigt, at der er en væske / væske grænseflade under forbindelsen, hvis der er nogen luft, så vil dette udgøre en luftspalte i systemet, som vil forstyrre endotelmonolaget under tilbagetrækning sprøjten trin. Leukocyt opløsning i sprøjtecylinderen kræver regelmæssig omrøring for at sikre, at cellerne ikke sætter sig, således at opretholde en konstant celletæthed hele forsøget. Under optagelsen trin, er det vigtigt at sikre billedet af endothellaget er tilstrækkeligt fokuseret og klar til at tillade nøjagtig offline analyse, og at der i det andet trin af strømmen assay (post leucocyte bolus), som nok tid der er tilbage i løbet af vaskebuffer fase, før optagelsen genoptages for at sikre,alle adhærerende leukocytter er fjernet. Ligeledes er det vigtigt at anvende endotelceller i et monolag af passende tæthed for at undgå tab af celler, som kan interferere med strømningsmønstre i snævre kapillærer og også kan være svært at skelne fra større adhærente leukocytter under fasekontrastmikroskopi. Vi har beskrevet optimal podningstæthed for humane hepatiske sinusformede endotelceller, men kan variere mellem forskellige endotel bestande og arter. Der er gjort betydelige fremskridt i at studere leukocyt rekruttering i dyremodeller med intravital mikroskopi. Den største fordel ved flow adhæsionsassayet metode er, at leukocyt rekruttering kan studeres i et binært system med primære humane endotelceller. Desuden kan disse interaktioner undersøges under fysiologiske relevante niveauer af forskydningsspænding. Det er vigtigt at bekræfte resultaterne af intravital studier i dyr med menneskelige cellulære systemer, da der kan være differences i endotel egenskaber mellem arter. En af de begrænsninger af strømmen assayet er, at leukocyt rekruttering bliver undersøgt i en encellet miljø endotelmonolaget. Ud over, når leukocytterne har levet og transmigrated tværs endotelet kan de ikke være i stede i tilstrækkeligt antal til at blive isolerede og underkastet downstream processer. På trods af disse begrænsninger, når strømmen adhæsionsassayet er styr på det kan udvikles til at udføre yderligere analyse af leukocyt adhæsion kaskade og tilpasset til rekapitulere en flercellede miljø. Langvarig optagelse af enkelte felter og anvendelse af tracking software kan bruges til at analysere gennemsøgning adfærd leukocytterne. Desuden ved afslutningen af ​​flowet assay microslides kan spørges ved hjælp af laser scanning konfokal mikroskopi og immunofluorescent mærkning for at studere vedhæftning og sjælevandring i flere detaljer. Derudover har vi tidligere udvikleed en in vitro-model, hvor der strømmer leukocytter kan interagere med nedsat endotel betinget af tilstedeværelsen af hepatocytter. Denne analyse kan også udvikles til at studere subpopulationer af leukocytter: vores gruppe har udført studier med delmængder såsom regulatoriske T-celler, B-celler og lever infiltrerende leukocytter. Disse undersøgelser er bevis for, at strømmen adhæsionsassayet er et kraftfuldt værktøj til at studere generel og orgel specifik leukocyt rekruttering i menneskelige systemer.

Det er nu almindeligt anerkendt, at leukocyt rekruttering i almindelighed følger paradigme for den multistep vedhæftning kaskade 1. Dette indebærer opsamling af leukocytterne strømmende blod af endotelceller foring karvæggen. I første omgang, leukocytter gennemgå en rullende skridt, som er medieret af selectin receptorer eller medlemmer af immunoglobulinsuperfamilien. Dette giver G-protein-koblede receptorer (GPCR) udtrykt på leukocyt-overflade, der skal aktiveres af kemokiner præsenteret på endotel glycocalyx. Dette fører til ændring af bekræftelse integrin til en &quot;høj affinitet&quot; stat på leukocyt overflade og arrestere og fast vedhæftning til endotel. Faste adhæsion efterfølges af formændring og gennemgang af leukocyt på fartøjet. Det sidste trin er transmigration gennem endotelmonolaget, som kan ske via paracellulære eller transcellulære ruter. Mens multistep vedhæftning kaskade beskrives den generelle mekanisme for leukocyt rekruttering i kroppen er der orgel specifikke forskelle. I leveren størstedelen af leukocyt rekruttering sker inden de hepatiske sinusoids i modsætning til andre organer, hvor rekrutteringen sker generelt inden for de post-kapillære venuler 2. De hepatiske sinusoider er lav forskydning miljø og leukocytter underkastes en kort tethering skridt forud for fast adhæsion som selectin uafhængig 2. Disse kanaler er foret med det hepatiske sinusformet endotel som er diskontinuert og indeholder fenestrae, åbne porer 100-200 nm i diameter, og mangler en basalmembran 3. Belyse de molekylære mekanismer, der medierer leukocyt rekruttering på tværs af human lever sinusformet endotel kunne identificere orgel specifikke terapeutiske mål for inflammatoriske leversygdomme. Flow adhæsionsassays er vigtige redskaber i at studere leukocyt rekruttering. De tillader genopbygningen af ​​leukocyt recruitment i overværelse af forskydningsspænding til at analysere vedhæftning under veldefinerede kræfter. Den hyppigste anvendelse til assayet er studiet leucocyt adhæsion til dyrkede endotelceller monolag eller oprensede substrater. Kommercielt tilgængelige strømningskamre bruges til perfundere celler under forhold med laminar strømning mellem to flade overflader, og derefter visualisere den dynamiske proces af vedhæftning på et mikroskop 4.. Tidligere grupper har vist, at visse klæbende interaktioner kun ske under flow og ikke kan studeres i statiske analyser 5,6. Vi har brugt denne teknik til at rekapitulere de hepatiske sinusoider og studere leukocyt rekruttering under forhold med lav forskydningsspænding. Primære humane Hsec dyrkes i microslides og leukocytter kan derefter perfunderet i denne monolag ved en strømningshastighed beregnet til at gengive forskydningsspænding inden hepatiske sinusoider. Det shear stress er en stress, der anvendes parallelt eller tangerer en overflade som opposed til normal stress, som er vinkelret. Enhver væske, der bevæger sig langs en grænse, vil udøve en forskydningsspænding på denne grænse. Shear stress har vist sig at være en væsentlig bestanddel af lymfocyt sjælevandring 7. Under disse betingelser hvert trin af vedhæftning kaskade kan visualiseres ved fasekontrast mikroskopi. Denne metode har givet vigtig indsigt i rekruttering af leukocytter i leveren, herunder undersøgelse af konventionelle adhæsionsmolekyler 8, rolle chemokiner og chemokinreceptorer 9-11, og atypiske adhæsionsmolekyler, såsom det vaskulære adhæsionsprotein-1 (VAP-1- ) 8,12 og fælles lymfe-og vaskulær endotel-receptor-1 (CLEVER-1) 13. Mens dette assay er blevet nævnt i flere af vores gruppe publikationer har sin beskrivelse været kort, og vi har benyttet lejligheden til at give en detaljeret trin for trin guide til at hjælpe med fejlfinding og forhindre tekniske fejl, når forsøgning assayet. Desuden har vi for nylig ændret sourcing af mikroobjektglas kamre som tillader præcise ændringer i forskydningsspænding. Vi mener, at dette udvider anvendeligheden af ​​assayet til andre endotheliale og immunceller. Følgende metode beskriver fremstillingen og teknik til at udføre et flow baseret adhæsionsassay med humane hepatiske sinusformede endotelceller og perifere blod-lymfocytter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

Leucocyte infiltration i humant levervæv er en fælles proces i alle voksne inflammatoriske leversygdomme. Kronisk infiltration kan drive udviklingen af ​​fibrose og progression til skrumpelever. Forståelse af de molekylære mekanismer, der medierer leukocyt rekruttering til leveren kunne identificere væsentlige terapeutiske mål for leversygdom. Nøglen interaktion under leukocyt rekruttering er, at af inflammatoriske celler med endotel under forhold med shear stress. Rekruttering til leveren sker inden de lave shear kanaler leverens sinusoider, som er foret med hepatiske sinusformede endotelceller (Hsec). Betingelserne i de hepatiske sinusoider kan sammenfattet ved perfusion leukocytter gennem kanaler foret af menneskelige Hsec monolag på bestemte strømningshastigheder. Under disse betingelser leukocytter underkastes en kort tethering trin efterfulgt af aktivering og fast vedhæftning, efterfulgt af en kravlende trin og efterfølgende transmigrering over endotellag. Brug af fasekontrastmikroskopi, kan hvert trin af denne &quot;vedhæftning kaskade&quot; visualiseres og registreres efterfulgt af offline analyse. Endotelceller eller leukocytter kan forbehandles med inhibitorer for at bestemme betydningen af ​​specifikke molekyler under denne proces.

Dette assay har evnen til at visualisere multistep flow vedhæftning kaskade og belyse de underliggende molekylære mekanismer ved at sammenligne resultaterne af kontrolforsøg til dem med molekylære inhibitorer. Forskellige vaskulære senge kan sammenfattet ved at indarbejde specifikke endotelceller og ændre shear stress. Hvert trin i vedhæftning kaskade kan analyseres offline ved at følge optagelsen metode skitseret i protokollen. Det første trin i vedhæftningen kaskade er rulning af leukocytter, som kan udtrykkes som en procentdel af den samlede adhærente celler. Offline analyse giver antallet af adhærente celler, der skal optælles i hvert registreret område i leukocyt bolus. Afspilning af billedet tillader sammenligning af celler, der er fast vedhængende og dem, der gennemgår en rullende bevægelse på tværs af endotel. Rullende bevægelse kan visualiseres ved anvendelse af denne teknik, er hvert felt registreres i mindst 10 sek. Rolling celler identificeres ved deres reducerede hastighed i løbet endoteloverfladen forhold til strømmende celler. Denne adfærd skal påvises for mindst 5 sek uden tilknytning. Vedhæftningen kaskade i de hepatiske sinusoider finder sted i et miljø med lav forskydning og in vivo-undersøgelser har bekræftet minimal rullende med kun en kort tethering trin. Vi har bekræftet, at strømmen analysen afspejler miljøet af de hepatiske sinusoids ved at demonstrere, at færre end 10% af vedhængende leukocytter vedholdende rulle over stimuleret Hsec i disse analyser. Det næste trin i vedhæftningen kaskade er fast vedhæftning. Samlet tilslutning kan beregnes ud fra den anden fase af optagelse under vaskebuffer bolus (trin 7.3). Offline analyse giver det totale antal fast vedhæftende celler der skal tælles i hvert felt (figur 5). Fast klæbende celler er defineret som celler, der er stationær eller shapechanged med langsom kravlende adfærd.Det gennemsnitlige antal celler pr kan derefter beregnes. Dette tal kan derefter anvendes i forbindelse med det samlede overfladeareal af synsfeltet (bestemt ved hjælp af en gradnet eller tilsvarende), koncentration af lymfocytter (typisk 1 x 10 6 celler / ml), og strømningshastigheden for at udtrykke omfanget af lymfocyt adhærens som adhærente celler / mm 2/10 6 celler perfunderet. Studere mønstret af friktion indebærer en analyse af de to sidste trin af vedhæftning kaskade, herunder form-forandring, kravle og transendothelial migration. Leukocytter vedhængende til den øvre overflade af Hsec monolag vises fase-lys, mens de, der har migreret gennem monolaget vises fase mørke (figur 6). Cellerne kan derefter klassificeres som udstille »statisk« friktion (nonmigrated / rund), »form-ændret &#39;morfologi eller som&quot; migreret&#39; og enkelte kategorier er derefter udtrykt som en procentdel af densamlede klæbende befolkning. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Figur 1. Monolag af primære humane hepatiske sinusformede endotelceller i strømningskammeret. A) Microslides fyldt med medier, der indeholder monolag af endothelceller før påbegyndelse af flow adhæsionsassay. B) Fase kontrast billede af sammenflydende endotelmonolaget bør endotelceller seedes i mikroobjektglas som er blevet præcoatet (for humane hepatiske endotelceller dette bør være med rotte hale kollagen type 1), og det er vigtigt, at de endotelceller er sunde i kultur og sammenflydende. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. Flow assaykammeret. En strøm assaykammeret opsætning kan ses her, består af et transparent kammer, som er monteret på et inverteret mikroskop. En ovn er anbragt i kammeret, og bør termostatstyret for at opretholde en temperatur på 37 ° C. Der bør være tilgængelige porte til at forbinde silikoneslange fra et mikroobjektglas inden i kammeret til en sprøjtepumpe, som er beliggende udenfor. Den mikroobjektglas er placeret direkte på mikroskopbordet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> Figur 3. Sprøjtepumpe. En sprøjtepumpe er forbindeed via silikoneslanger til strømmen kammeret. Pumpen er indstillet til en specifik tilbagetrækning sats afhængig af den ønskede forskydningsspænding kræves til analysen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> . <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> Figur 4.. Tilslutning ventil til at flyde kammer. A) En elektronisk magnetventil funktion skifter mellem to sprøjtecylindrene indeholder enten celler eller medier med næsten ingen døde rum. B) Når ventilen er skyllet, og de ​​to tønder er sat op, siliconeslangerne fra ventilen er forbundet med strømningskammeret. Det er afgørende, at når du tilslutter adapteren på siliconeslangerne til porten på strømningskammeret der er en væske / væske-grænsefladen. &lt;a href = &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klik her for at se større billede. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> Figur 5. Måling af total leukocyt vedhæftning. I løbet af de sidste to minutter af vaskebuffer bolus skridt (som beskrevet i protokollen), skal registreres mindst ti tilfældige felter. Disse kan analyseres off-line og det samlede antal af fast fastklæbende celler kan tælles i hvert felt. Samlet vedhæftning af leukocytter kan sammenlignes mellem styrekamre og dem forbehandlet med blokerende antistoffer, her viser vi et repræsentativt felt fra en kontrol dias og et dias forbehandlet med intracellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) blokerende antistof. Pile er blevet tilføjet for at fremhæve vedhængende leukocytter i reprætive felt fra styreskyderen er der i alt 25 leukocytter identificeret og i ICAM-1 blok slide er der i alt 13 leukocytter identificeret. Skalapanelerne = 100 mM. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> . <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> Figur 6. Analyse af mønstret af leucocyt adhæsion på endotel monolag af fasekontrastmikroskopi. Offline analyse af registrerede felter kan også anvendes til at studere retningen og hastigheden af leucocyt adhæsion. Specifikke trin i vedhæftning kaskade kan visualiseres og kvantificeres ved hjælp af fasekontrast billeddannelse. Fase lyse celler, som er fast klæbende, men ikke aktiveret kan betegnes »runde« vedhæftning, de celler, som er aktivered og fase lys kan kaldes »facon ændret &#39;og de celler, som er fase mørke er de celler, der har undergået transendothelial migration og kan kaldes» migreres. Billedet viser eksempler på hvert mønster af friktion. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress at JoVE.com

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte rekruttering til leveren sker inden de specialiserede kanaler leverens sinusoider, som er foret med unikke hepatiske sinusformede endotelceller. Fasekontrastmikroskopi af leukocyt rekruttering på tværs af human hepatisk sinusformet endotel under betingelser med fysiologisk forskydningsspænding kan lette opklaringen af ​​de molekylære mekanismer, der ligger til grund for denne proces.

En Flow Vedhæftning Assay til at studere Leucocyte Rekruttering til human hepatiske Sinusformede endotel Under betingelser for forskydningsspænding

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering af Humane navlevene-endotelceller og deres anvendelse i undersøgelsen af ​​neutrofil transmigration Under strømningsforhold

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til Studieinformationen Heterogeneity for Human Makrofag Differentiering og polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Human neutrofil strømningskammeret adhæsionsassay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Static adhæsionsassayet for Studiet af Integrin Aktivering i T-lymfocytter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og hurtig protokol til ikke-enzymatisk dissociere frisk humant væv til analyse af lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro og in vivo model til at studere bakteriel adhæsion til karvæggen Under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...