Name: a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress
Uploaded: 2014-03-21T15:30:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress at JoVE.com

SS er finansiert av en Wellcome Trust Intermediate Klinisk Fellowship, CW av en Wellcome Trust Programme Grant.

En. Microslide Forberedelse <ol><li> Forbelegge en seks-kanals microslide med rottehale kollagen type I (RTC, fortynnet 1:100 i PBS som gir en arbeider fortynning på 220 pg / ml). Dette blir utført ved å injisere 30 pl av fortynnet RTC-løsning direkte inn i kanalene og inkubering i 2 timer ved 37 ° C, etterfulgt av tre vaskinger med PBS. </li></ol> 2. Seeding Celler i Microslides <ol><li> Dissosiere et konfluent T75 kolbe av dyrkede humane hepatiske sinusoidale endotelceller (HSEC) (isolert fra lever-vev, som beskrevet tidligere 13) i trypsin-EDTA, vask i PBS, og resuspender med 3 x 10 6 celler / ml i komplett medium (human endotelial basale medier supplert med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 pg streptomycin, 10% varme-inaktivert AB humant serum og 10 ng / ml av vaskulær endotelial vekstfaktor og 10 ng / ml av hepatocytt-vekstfaktor). Injisere 30 mL av cellesuspensjon Directly inn i hver kanal. </li><li> La celler til å følge i 1 time i en fuktet inkubator ved 37 ° C med en 5% CO 2 atmosfæren på et lysbilde rack. Etter å la cellene få feste seg fylle åpningene på hver side av hver kanal med komplett medium (figur 1). </li></ol> Tre. Cytokin Stimulering av celler <ol><li> La celler i inkubator i 24 timer. Vurdere cellevekst ved hjelp av et invertert fasekontrastmikroskop. 24 timer før adhesjonen assay, stimulere endotelceller monolag med cytokin ved å erstatte vekstmedier med komplette medier supplert med tumornekrosefaktor alfa og interferon-gamma, både ved 10 ng / ml. </li></ol> 4. Isolering av perifere blodlymfocytter <ol><li> Isoler perifere blodlymfocytter fra fullblod ved først å rense mononukleære fraksjon ved tetthetsgradient-sentrifugering over en egnet celleseparasjonsmateriale sentrifugering i 25 minutter ved 800x g. Inkuber cellene på plast i 1 time for å tillate tilslutning av monocytter. </li><li> Etter tilslutning til plast aspirer lymfocytt beriket supernatant. Vask lymfocyttene og resuspendere dem (typisk 1 x 10 6 celler / ml i strømningsmediet (endoteliale basalmedier inneholdende 0,1% (v / v) bovin serum albumin (BSA)). </li></ol> 5. Forbehandling av Endotelet eller Leukocytter med hemmere <ol><li> Forbered anbefalte fortynninger av funksjonsblokkerende antistoffer eller små molekyl-inhibitorer i endotelial media/0.1% (v / v) BSA. Skift ut komplett medium med blokkering antistoff / inhibitor løsning i valgt microslide kanal 30 min før strømme analysen. </li><li> Når forbehandling av chemokine reseptorer på lymfocytter planlegges, resuspender isolerte leukocytter i RPMI-løsning inneholdende 0,1% (v / v) BSA og inkuberes med 200 ng / ml av Pertussis Toxin å blokkere G-protein koblet reseptor aktivitet av chemokine reseptorer, alternativt fortynne spesifikk funksjonblokkerer antistoffer eller lite molekyl hemmere av chemokine reseptorer på anbefalt fortynning. Inkuber leukocytter ved 37 ° C i 30 min, og deretter vaske og resuspendere i strømningsmediet. </li></ol> 6. Oppsett av Flow analysesystem <ol><li> Prewarm en termostatstyrt gjennomsiktig kammer til 37 ° C. Kammeret bør ha porter for innsetting av silikonslange, og elektronisk tilførsel for et elektronisk magnetventil som muliggjør veksling mellom celler og media med praktisk talt ikke noe dødvolum. Kammeret er montert på en invertert mikroskop for å tillate fasekontrastmikroskopi. Figur 2 viser strømningsanalysekammeret og mikroskop og microslide plassert på objektbordet. </li><li> Forhåndsutfyll en 50 ml glassprøyte med en Luer-lås med 10 ml sterilt destillert vann og feste en lengde på 25 cm silikonslanger til sprøyten port. Sett i en sprøytepumpe. Alter tilbaketrekkhastighet på sprøytepumpen ifølgeden microslide produsentens instruksjoner for å opprettholde en skjærspenning på 0,05 Pa (0,5 dyne / cm 2, Figur 3). </li><li> Ta to 5 ml sprøyter, forkaste stempler og fest fat til de to i-flow portene på en elektronisk magnetventil med silikonslanger. <ol><li> Fest 12 cm av silikonslange til ut-strømningsventil. Ventilen muliggjør veksling mellom et cellefritt vaskebuffer (endotelial media/0.1% (v / v) BSA) og lymfocytt-suspensjon. </li><li> Skyll det elektroniske magnetventil ved å sette vaskebuffer i begge sprøyte fat og sikre buffer strømmer fra den ene sylinderen gjennom ventilen og inn i ut-strømningssilikonslange. </li><li> Bruk ventilen bryter for å veksle til den andre sylinderen, og sikre at bufferen er flytende og at alle bobler er fjernet fra systemet. Fjern vaskebuffer fra en av tønner og erstatte med lymfocytt-suspensjon figur 4a. </li></ol></li><li> Koble silikon tubing fra sprøytepumpen til en port av et valgt microslide kanal via en microslide adapter. Deretter kobler du silikonslanger fra utløpsventilen til motsatt port via en microslide adapter. Påse at silikonrøret og adaptere er fylt med vaskebuffer før tilkoblingen å hindre luftbobler kommer inn i systemet (figur 4b). </li><li> Når festet til strømningssystemet, plasseres microslide på objektbordet og festes med klemmer eller tape for å hindre bevegelse. Still mikroskopet til 10X objektiv sammen med den aktuelle fasen innstillingen. Sørg for at endothelial monolayer er visualisert og i fokus med okulær objektivet. Sikre bilder kan tas via et kamera som er festet til mikroskopet, hvorved bilder kan bli videresendt til en monitor og registrert. </li></ol> 7. Flow Analyseteknikk og opptak av vedheft for analyse <ol><li> Perfuse endothelial lag med vaskebuffer for 2 min med oppstart withdrawal av sprøyten pumpe for å fjerne eventuelle rester eller ubundne blokkerende antistoff og deretter bytte ventilen for å tillate en 5 min bolus av leukocytt-løsning ved en konstant veggskjærspenning på 0,05 Pa </li><li> I løpet av de siste 2 min av leukocytter bolus, spille inn 10 tilfeldige felt langs lengden av microslide. Dette gjør offline analyse av lymfocytter rullende / tethering på endothelial monolayer. Spill hvert felt for ca 10 sek før han flyttet til den neste, og sørge for at opptak blir gjort mot strømningsretningen for å unngå å ta opp den samme rullende celle to ganger i rask rekkefølge. </li><li> Flg leukocytter bolus med en 5 min bolus vaskebuffer ved å returnere ventilen til dens startposisjon. Under den avsluttende 2 min på denne bolus en andre opptaksfase gjennomføre ved å velge minst 10 tilfeldig utvalgte områder langs lengden av den microslide. Spill hvert felt for ca 5 sek før du går til neste, og sørge for at endothelial monolayer og tilhenger leucocytes er i klart fokus. Dette tillater ikke aktiv analyse av mønsteret av adhesjon. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser

Den mest kritiske trinn for med hell å utføre en strømnings analysen er å sikre at en sunn og sammenvoksende monolag av endotelceller er klar før strømnings adhesjon assay. Primære endotelceller kan være vanskelige å dyrke og følsomme for forandringer i dyrkningsmetoder. Det er viktig at en) strømnings kamrene er tilstrekkelig og jevnt belagt med endotelceller i en monolayer, for HSEC vi bruke rotte hale kollagen type I, men dette kan variere for andre endothelial populasjoner, 2) kultur medium er hensiktsmessig for den celletype, for HSEC vi har beskrevet vår komplett medium i protokollinformasjonen. Andre viktige skritt er å sette sprøytepumpen på riktig sats for å reflektere fysiologiske nivåer av skjærspenning. Under strømnings assay er det nødvendig å hindre at luftbobler inne i strømningskrets som kan skade endotelial monolag eller strippe immunceller fra endotelial overflate. Dette kan forebygges ved ensuring at alle silikonslanger og adaptere perfundert med vaskebuffer før tilkobling, at alle luftbobler er fjernet og at media er forvarmet før bruk. Ved tilkobling av adaptere til portene på microslide er det svært viktig at det er en væske / væske-grensesnittet under tilkobling, hvis det er noe luft da dette vil danne en luftspalte i systemet som vil forstyrre endothelial monolayer under sprøyten tilbaketrekking trinn. Den leukocytter oppløsning i sprøytesylinderen trenger regelmessig agitering for å sikre at cellene ikke slå seg, og dermed opprettholde en konstant celletetthet gjennom hele eksperimentet. Under opptaksfremgangsmåten er det viktig å sikre at bildet av den endoteliale lag er tilstrekkelig konsentrert og klar til å tillate nøyaktig analyse frakoblet, og at i løpet av det andre trinnet av strømnings assay (post leukocytter bolus) at tilstrekkelig tid er igjen i løpet av vaskebuffer fasen før opptaket påbegynnes for å sikre atalle ikke-festede leukocytter fjernes. Likeledes er det viktig å bruke endotelceller i et monosjikt av passende tetthet for å hindre tap av celler som kan forstyrre strømningsmønster i trange kapillarer og også kan være vanskelig å skille fra større adherente leukocytter i henhold til fasekontrastmikroskopi. Vi har beskrevet optimal seeding tetthet for humane sinusformet endotelceller, men dette kan variere mellom ulike endothelial populasjoner og arter. Betydelige framskritt er gjort i å studere leucocyte rekruttering i dyremodeller med intramikroskopi. Den store fordelen med strømnings adhesjon bestemmelsesmetoden er at leukocytter rekrutteringen kan studeres i et binært system med primære humane endotelceller. Videre kan disse interaksjonene studeres under fysiologiske relevante nivåer av skjærspenning. Det er viktig å få bekreftet funn av intra studier i dyr med menneskelige cellulære systemer som det kan være forskjelleres i endothelial egenskaper mellom arter. En av begrensningene i den flyt-analysen er at leukocytter rekruttering blir studert i en encellet miljø av endotelial monolayer. I tillegg når leukocyttene er overholdt, og transmigrated tvers av endotelet kan de ikke være i tilstede i tilstrekkelig antall til å bli isolert og utsatt for nedstrømsprosesser. Til tross for disse begrensninger, når strømnings adhesjon analyse er blitt mestret det kan utvikles for å utføre videre analyse av leukocytt adhesjon kaskade, og innrettet til å rekapitulere en flercellet miljø. Langvarig opptak av enkelt felt og bruk av sporing kan brukes til å analysere krypende oppførsel av leukocyttene. Videre ved gjennomføring av flyt-test microslides kan bli avhørt ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi og immunofluorescent merking for å studere vedheft og sjelevandring i mer detalj. I tillegg har vi tidligere utviklered en in vitro-modell der strømmer leukocytter kunne interagere med hepatisk endotel betinget av tilstedeværelsen av hepatocytter. Denne analysen kan også bli utviklet for å studere subpopulasjoner av leukocytter: vår gruppe har utført studier med undergrupper som regulatoriske T-celler, B-celler, og lever infiltrere leukocytter. Disse studiene er bevis for at flyten vedheft analysen er et kraftig verktøy for å studere generell og organspesifikk leucocyte rekruttering i menneskelige systemer.

Det er nå godt etablert som leucocyte rekruttering generelt følger paradigmet av multistep vedheft kaskade en. Dette innebærer innsamling av leukocytter fra rennende blod av endotelceller lining åreveggen. Til å begynne med leukocytter gjennomgå en valsetrinnet som er mediert av selektin-reseptorer eller medlemmer av immunglobulin superfamilien. Dette gjør det mulig for G-protein koblede reseptorer (GPCR) uttrykt på leukocytter overflaten som skal aktiveres av kjemokiner som presenteres på endotelial glycocalyx. Dette fører til en endring av integrin bekreftelse til en &quot;høy affinitet&quot; tilstand på leukocytter overflate og gripe og fast adhesjon til endotel. Firm heft blir så fulgt av formen endring og gjennomgang av den leucocyte på fartøyet. Det siste trinnet er sjelevandring gjennom endothelial monolaget, som kan skje via paracellular eller transcellular ruter. Mens multistep vedheft kaskade beskrives den generelle mekanisme for leukocytter rekruttering i kroppen er det organspesifikke forskjeller. I leveren skjer flertallet av leucocyte rekruttering innenfor lever sinusoidene i motsetning til andre organer hvor rekruttering generelt skjer innen post-kapillær venules to. Hepatiske sinusoids er en lav skjær miljø og leukocytter gjennomgå en kort tethering skritt før firmaet vedheft som selektin uavhengig to. Disse kanaler er foret med hepatisk sinusformet endotelet som er diskontinuerlig og inneholder fenestrae, åpne porer 100-200 nm i diameter, og mangler en basalmembran 3. Belyse de molekylære mekanismene som formidler leucocyte rekruttering på tvers av menneskelig leversinusformet endotelet kunne identifisere organ spesifikke terapeutiske mål for inflammatoriske leversykdommer. Flow vedheft analyser er viktige verktøy i å studere leucocyte rekruttering. De tillater gjenoppbyggingen av leucocyte farten påitment i nærvær av skjærspenning å analysere vedheft under godt definerte styrker. Den vanligste anvendelse for analysen er studiet leukocytt adhesjon til dyrkede endotelceller monolag eller rensede substrater. Kommersielt tilgjengelige strømningskamrene blir brukt til å gjennomstrømme cellene under betingelser for laminær strømning mellom to flate overflater, og deretter visualisere den dynamiske prosessen med adhesjon på et objekt 4.. Tidligere grupper har vist at visse adhesive interaksjoner foregå under strømning, og kan ikke bli studert i statiske analyser 5,6. Vi har brukt denne teknikken for å rekapitulere de lever sinusoidene og studere leucocyte rekruttering under forhold med lav skjærspenning. Primær human HSEC dyrkes i microslides og leukocytter kan deretter perfusert i løpet av dette monosjikt ved en strømningshastighet beregnet til å reprodusere den skjærspenning i hepatiske sinusformer. Skjærspenningen er et stress som påføres parallelt eller tangential til en overflate som Opposed til normal belastning, som er vinkelrett. Enhver væske som beveger seg langs en grense vil utøve en skjærspenning på at grensen. Shear stress har vist seg å være en viktig del av lymfocytter sjele 7. Under disse betingelser hvert trinn av adhesjonen kaskade kan visualiseres ved fasekontrastmikroskopi. Denne fremgangsmåte har gjort det mulig viktig innsikt inn i rekruttering av leukocytter i leveren med studiet av konvensjonelle adhesjonsmolekyler 8, rollen av kjemokiner og chemokine reseptorer 9-11, og atypiske adhesjonsmolekyler slik som vaskulære adhesjon protein-1 (VAP-1 ) 8,12 og felles lymfesystemet og vaskulær endotelial reseptor-1 (SMART-1) 13. Mens denne analysen har vært nevnt i flere av våre konsernets publikasjoner har sin beskrivelse vært kort, og vi har benyttet anledningen til å gi en detaljert trinnvis guide for å hjelpe i feilsøking og hindre tekniske feil når forsøking analysen. Videre har vi nylig endret sourcing av microslide kamre som gir nøyaktige endringer i skjærspenning. Vi tror at dette utvider anvendbarheten av analysen til andre endotel-og immunceller. Følgende fremgangsmåte beskriver fremstillingen og teknikk for utførelse av en strømningsbasert adhesjon analysen med humane hepatiske sinusoidale endoteliale celler og perifere blodlymfocytter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

Leucocyte infiltrasjon i menneskelig levervev er en vanlig prosess i alle voksne inflammatoriske leversykdommer. Kronisk infiltrasjon kan drive utviklingen av fibrose og progresjon til cirrhose. Forstå de molekylære mekanismene som formidler leucocyte rekruttering til leveren kunne identifisere viktige terapeutiske mål for leversykdom. Nøkkelen samhandling under leucocyte rekruttering er at av betennelsesceller med endotelet under forhold med skjærspenning. Rekruttering til leveren skjer innen de lave skjær kanaler av hepatiske sinusformer som er foret med hepatiske sinusoidale endotelceller (HSEC). Forholdene innenfor lever sinusoidene kan recapitulated ved perfusert leukocytter gjennom kanaler omgitt av menneske HSEC monolayers på spesifikke strømningshastigheter. Under disse betingelser leukocytter gjennomgå en kort deling trinn etterfulgt av aktivering og fast adhesjon, etterfulgt av en krypende trinn og påfølgende transmigrasjon på tvers av endoteliallag. Ved hjelp av fasekontrastmikroskopi, kan hvert trinn i denne &#39;adhesjon kaskade&#39; bli visualisert og registrert fulgt av aktiv analyse. Endoteliale celler eller leukocytter kan være forbehandlet med inhibitorer for å bestemme rollen til spesifikke molekyler i løpet av denne prosessen.

Denne analysen har evnen til å visualisere flertrinns strømnings adhesjon kaskade og belyse de underliggende molekylære mekanismer ved å sammenligne resultatene av kontrollforsøk med de med molekyl inhibitorer. Ulike vaskulære senger kan recapitulated ved å innarbeide endotelceller og endre skjær stress forhold. Hvert trinn av adhesjonen kaskade kan analyseres frakoblet ved å følge opptaksmetoden beskrevet i protokollen. Det første trinn i kaskade adhesjon er den rullende leukocytter som kan uttrykkes som en prosentandel av totale adherente celler. Frakoblet analyse tillater antallet adherente celler til å være nummerert i hvert felt registreres i løpet av leukocytter bolus. Avspilling av bildet gjør det mulig for sammenligning av celler som er godt vedheftende og de som gjennomgår en rullende bevegelse på tvers av endotelet. Rullende bevegelse kan visualiseres ved hjelp av denne teknikken, er hvert felt registreres i minst 10 sek. Rullende celler er identifisert ved deres reduserte vannhastighet over hele endotelial overflate, sammenlignet med strømmer celler. Denne atferden må påvises i minst 5 sek uten avløsning. Adhesjonen kaskade innenfor de hepatiske sinusoids finner sted i en omgivelse med lav skjærkraft og in vivo-studier har bekreftet minimal valse med bare en kort deling trinn. Vi har bekreftet at strømnings assay reflekterer miljø av de hepatiske sinusformer ved å demonstrere at mindre enn 10% av adherente leukocytter vedvarende rulle over stimulerte HSEC i disse assays. Det neste trinn i kaskade adhesjon er fast adhesjon. Total tilslutning kan beregnes ut fra det andre trinn med å samle inn under vaskebuffer bolus (trinn 7.3). Frakoblet analysen kan det totale antall fast heftende celler som skal telles i hvert felt (figur 5). Fast heftende celler er definert som celler som er i ro eller shapechanged med sakte krypende atferd.Det gjennomsnittlige antall celler pr feltet kan deretter beregnes. Dette tallet kan da brukes, sammen med det totale overflateareal av synsfeltet (bestemt ved hjelp av et gradnett eller tilsvarende), konsentrasjonen av lymfocytter (typisk 1 x 10 6 celler / ml), og strømningshastigheten for å uttrykke graden av lymfocytt tilslutning som heftende celler / mm 2/10 6 celler perfundert. Studerer mønsteret av adhesjonen involverer analyse av de to siste trinnene av adhesjon kaskade inneholder formendring, gjennomgang og transendothelial migrasjon. Leukocytter heftende til den øvre overflaten av monolaget HSEC vises fase-lyse, mens de som har migrert gjennom monolaget synes mørk fase (fig. 6). Cellene kan da klassifiseres som utstiller &quot;statisk&quot; heft (nonmigrated / runde), &#39;form endret&#39; morfologi eller som &quot;utvandret&quot; og enkelte kategorier blir deretter uttrykt som en prosentandel avtotal lim befolkningen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Figur 1. Monolayer av primære humane sinusformet endotelceller innen strømningskammeret. A) Microslides fylt med media inneholdende monolag av endotelceller før oppstart av strømnings adhesjon assay. B) fasekontrastbilde av konfluent monolag endotelial bør endotelceller blir utsådd i microslide som har blitt forbelagt (for humane endotelceller dette bør være med rotte hale kollagen type 1), og det er viktig at endotelcellene er sunt i kultur og konfluent. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. Strømningsanalysekammeret. En strømningsanalysekammer set-up kan ses her, den består av en gjennomsiktig kammer som er montert på et invertert mikroskop. Et varmeelement er plassert i kammeret og bør være termostatstyrt for å opprettholde en temperatur på 37 ° C. Det bør være tilgjengelige porter for å koble silikonslange fra en microslide inne i kammeret til en sprøytepumpe som er plassert utenfor. Den microslide er plassert direkte på mikroskopet scenen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> Figur 3. Sprøytepumpe. En sprøyte pumpe er å kobleed via silikonslange til strømningskammeret. Pumpen er innstilt på en bestemt uttakshastighet, avhengig av den ønskede skjærspenning som kreves for analysen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">for å vise større bilde</a> . <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> Figur 4. Tilkobling av ventilen kan strømme kammer. A) En elektronisk magnetventil tillater veksling mellom to sprøyte fat inneholdende enten cellene eller mediet praktisk talt uten dødrom. B) Når ventilen er spyles, og de ​​to løp er satt opp, silikonslangen fra ventil er koblet til strømningskammeret. Det er viktig at ved tilkobling av adapteren på silikonslanger til porten på strømningskammeret er det en væske / væske-grensesnitt. &lt;a href = &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klikk her for å se større bilde. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> Figur 5. Måling av total leucocyte tilslutning. Løpet av de siste to minuttene av vaskebuffer bolus trinn (som beskrevet i protokollen), bør et minimum av ti tilfeldige felt registreres. Disse kan bli analysert off-line, og det totale antall fast heftende celler kan telles i hvert felt. Total adhesjon av leukocytter kan sammenlignes mellom styrekamrene og dem forbehandlet med blokkerende antistoffer, her viser en representativ felt fra en styre lysbilde og et lysbilde forbehandlet med intracellulært adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) blokkerende antistoff. Piler er lagt til markere heft leukocytter, i representativttive felt fra styreglide er det totalt 25 leukocytter identifisert og i ICAM-1 blokk lysbilde er det totalt 13 leukocytter identifisert. Scale barer = 100 mikrometer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> Figur 6. Analyse av det mønster av leukocytter adhesjon på endoteliale monolag ved fasekontrastmikroskopi. Frakoblet analyse av registrerte felter kan også brukes til å studere retningen og hastigheten av leukocytt adhesjon. Spesifikke trinn av adhesjon kaskade kan bli visualisert og kvantifisert ved hjelp av fasekontrast-imaging. Fase lyse celler som er fast tilhenger, men ikke aktivert kan betegnes &#39;runde&#39; heft, cellene som er activated-og fase lyse kan betegnes &quot;-form endret &#39;, og de celler som er fase mørke er de celler som har gjennomgått migrasjon transendothelial og kan betegnes« migrerte&#39;. Bildet viser eksempler på hvert mønster av vedheft. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress at JoVE.com

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte rekruttering til leveren skjer innenfor spesialiserte kanaler av lever sinusoidene som er foret med unike leversinusformet endotelceller. Fasekontrast mikroskopi av leucocyte rekruttering på tvers av menneskelig leversinusformet endotelet under forhold med fysiologiske skjærspenning kan legge til rette for klarlegging av de molekylære mekanismene som ligger bak denne prosessen.

En Flow Adhesion analysen til Study leucocyte Rekruttering til humane Sinus endotelet under forhold med Skjær Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering av menneskelige umbilical vein endotelceller og deres bruk i studiet av Neutrofil Sjelevandring Under strømningsforhold

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere heterogenitet of Human Macrophage Differensiering og Polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Menneskelig Neutrophil Flow Chamber Adhesion analysen

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statisk feste analysen for Study of inte Activation i T-lymfocytter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og Rapid-protokollen til ikke-enzymatisk distansere Ferske menneskelig vev for analyse av infiltrerende Lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro og in vivo modell for å studere bakteriell adhesjon til fartøyet veggen under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...