Name: a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress
Uploaded: 2014-03-21T15:30:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress at JoVE.com

SS finansieras av en Wellcome Trust Intermediate Klinisk Fellowship, CW med Wellcome Trust Programme Grant.

1. Micro Framställning <ol><li> Förbeläggning en sex kanal mikros med råttsvanskollagen typ I (RTC, som spätts i PBS 1:100 ge en arbetsspädning av 220 | j, g / ml). Detta utföres genom att injicera 30 | il av utspädd RTC lösning direkt in i kanalerna och inkubering under 2 h vid 37 ° C, följt av tre tvättningar med PBS. </li></ol> 2. Sådd Celler i Microslides <ol><li> Dissociera ett konfluent T75 kolv med odlade humana hepatiska sinusoidala endotelialceller (Hsec) (isolerad från levervävnad, såsom tidigare beskrivits 13) i trypsin-EDTA, tvättas i PBS och återsuspendera i 3 x 10 6 celler / ml i komplett media (humant endotel basala medium kompletterat med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100μg/ml streptomycin, 10% värmeinaktiverat AB humant serum, 10 ng / ml av vaskulär endotelial tillväxtfaktor och 10 ng / ml av hepatocyte growth factor). Injicera 30 ul av cellsuspensionen directly i varje kanal. </li><li> Låt cellerna att vidhäfta under 1 h i en fuktad inkubator vid 37 ° C med en 5% CO2 atmosfär i en bild rack. Efter att låta cellerna vidhäfta fylla öppningarna på vardera sidan av varje kanal med fullständigt medium (figur 1). </li></ol> 3. Cytokinstimulering av celler <ol><li> Lämna celler i kuvös i 24 timmar. Bedöm celltillväxt med ett inverterat faskontrastmikroskop. 24 h före vidhäftningsanalysen, stimulera de endoteliala monoskikt med cytokin genom att ersätta odlingsmedier med komplett medium kompletterat med tumörnekrosfaktor alfa och interferon-gamma, såväl på 10 ng / ml. </li></ol> 4. Isolering av perifera blodlymfocyter <ol><li> Isolera perifera blodlymfocyter från helblod genom att inledningsvis rening av den mononukleära fraktionen av densitetsgradientcentrifugering över en lämplig cellseparation centrifuge media för 25 min vid 800X g. Inkubera cellerna på plast under 1 h för att medge vidhäftning av monocyter. </li><li> Efter anslutning till plast aspirera på lymfocyter berikade supernatanten. Tvätta lymfocyterna och återsuspendera dem (vanligtvis 1 x 10 6 celler / ml i strömningsmediet (endothelial basala media innehållande 0,1% (volym / volym) bovint serumalbumin (BSA)). </li></ol> 5. Förbehandling av Endothelium eller Leukocyter med hämmare <ol><li> Förbered rekommenderade spädningar av funktionsblockerande antikroppar eller små molekylhämmare i endotelial media/0.1% (vol / vol) BSA. Byt komplett medium med blockerande antikropp / inhibitorlösning i vald Microkanalen 30 min före flödesanalys. </li><li> Om förbehandling av kemokinreceptorer på lymfocyter är planerade, resuspendera isolerade leukocyter i RPMI-lösning innehållande 0,1% (volym / volym) BSA och inkuberades med 200 ng / ml av pertussis-toxin för att blockera G-proteinkopplad receptoraktivitet av kemokinreceptorer, alternativt späda specifik funktionblockerande antikroppar eller små molekyler hämmare av kemokinreceptorer vid rekommenderad utspädning. Inkubera leukocyter vid 37 ° C under 30 min, sedan tvätta och återsuspendera i flödesmediet. </li></ol> 6. Inställning av flödesanalyssystem <ol><li> Prewarm en termostatstyrd transparent kammare till 37 ° C. Kammaren bör ha portar för införing av silikonslang och elektronisk tillförsel för en elektronisk magnetventil som möjliggör omkoppling mellan celler och media med praktiskt taget ingen dödvolym. Kammaren är monterade på ett inverterat mikroskop för att tillåta faskontrastmikroskopi. Figur 2 visar analysen flödeskammaren och mikroskop och mikros placerad på mikroskopställningen. </li><li> Prefill en glasspruta 50 ml med en luer-lås med 10 ml sterilt destillerat vatten och fästa en längd av 25 cm silikontuben till sprutan porten. För in i en sprutpump. Förändra avdragningshastighet av sprutpumpen enligtden mikros tillverkarens instruktioner för att upprätthålla en skjuvspänning på 0,05 Pa (0,5 dyn / cm 2, figur 3). </li><li> Ta två 5 ml sprutor, kassera kolvarna och fäst tunnorna till de två i-flöde hamnar en elektronisk magnetventilen med silikonslangar. <ol><li> Bifoga 12 cm av silikonslang till ventilen ut-flödet. Ventilen medger växling mellan en cellfri tvättbuffert (endotelial media/0.1% (volym / volym) BSA) och lymfocytsuspensionen. </li><li> Spola elektroniska magnetventilen genom att sätta in tvättbuffert i både sprutcylindrarna och se buffert flödar från ett fat genom ventilen och in i utflödet slang silikon. </li><li> Använd ventilen omkopplaren växla till den andra cylindern och säkerställa bufferten strömmar och att alla bubblor avlägsnas från systemet. Avlägsna tvättbuffert från en av tunnorna och ersätta med lymfocytsuspensionen Figur 4a. </li></ol></li><li> Anslut silikon Tubing från sprutpumpen till en hamn i en vald Microkanal via en Microadapter. Anslut sedan silikonslang från utflödesventilen till motsatt port via en Microadapter. Kontrollera att silikontuben och adaptrar är fylld med tvättbuffert före kopplingen för att förhindra att luftbubblor kommer in i systemet (figur 4b). </li><li> Väl ansluten till flödessystemet, placera mikros på mikroskop scenen och fäst med clips eller tejp för att förhindra rörelser. Ställ in mikroskopet till 10X mål tillsammans med rätt inställning fasen. Se till endoteliala monoskiktet visualiseras och i fokus med okulär lins. Säker bilder kan tas via en kamera som är ansluten till mikroskopet varvid bilder kan reläas till en monitor och registrerades. </li></ol> 7. Flödesanalysteknik och inspelning av vidhäftning för analys <ol><li> BEGJUTA endotelskiktet med tvättbuffert under 2 minuter genom att påbörja withdrawal sprutpumpen för att ta bort eventuellt skräp eller obunden blockerande antikroppen och sedan växla ventilen för att låta en 5 min bolus av leukocyter lösning vid en konstant vägg skjuvspänning av 0,05 Pa </li><li> Under den sista 2 min av det leukocyt bolus, spela in 10 slumpmässiga fält längs längden av mikros. Detta tillåter offline analys av lymfocyter rullande / tjudra på endothelial monolager. Spela in varje fält i ungefär 10 sekunder innan du går vidare till nästa och se till att inspelningar görs mot flödesriktningen för att undvika att spela in samma rull cell två gånger i snabb följd. </li><li> Följ leukocyt bolus med en 5 min bolus tvättbuffert genom att returnera ventilen till sin startposition. Under det sista 2 min av denna bolus genomföra en andra inspelningsfasen genom att välja åtminstone 10 slumpmässigt valda fält utmed längden av den mikros. Spela in varje fält i ungefär 5 sekunder innan du går vidare till nästa och se till att den endothelial cellslager och anhängare leucocYtes är i tydligt fokus. Detta tillåter offline analys av mönstret för vidhäftning. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen

Det mest kritiska steget för att framgångsrikt utföra en assay flöde är att säkerställa att en sund och sammanflytande monoskikt av endotelceller är redo före vidhäftningen flödesanalys. Primära endotelceller kan vara svårt att odla och känsliga för förändringar i odlingsmetoder. Det är viktigt att en) flödeskammare på ett adekvat och likformigt belagd med endotel-celler i ett monoskikt, för Hsec vi använder råttsvanskollagen typ I men detta kan variera för andra endoteliala populationer, 2) odlingsmedium som är lämpligt för celltypen, för Hsec vi beskrivit vår komplett medium i protokollet avsnittet. Andra viktiga steg inkluderar att ställa in sprutpumpen på lämplig takt för att återspegla fysiologiska nivåer av skjuvspänning. Under analysflödet är det nödvändigt att förhindra att luftbubblor i flödeskrets, som kan skada den endoteliala monoskiktet eller remsa immunceller från endotelytan. Detta kan förhindras genom ensuring att alla silikonslangar och adaptrar perfusion med tvättbuffert före kopplingen, att alla luftbubblor avlägsnas och att medierna är förvärmt före användning. Vid anslutning av adaptrar till portarna på mikros är det mycket viktigt att det finns en vätska / vätskegränssnitt under anslutning, om det finns någon luft då detta kommer att bilda en luftspalt i systemet som kommer att störa endothelial monolager under sprutan tillbakadragande steget. Den leukocyter lösningen i sprutan fat behöver regelbunden agitation för att se till att cellerna inte nöja sig, därmed upprätthålla en konstant celltäthet under hela försöket. Under inspelningssteg är det viktigt att se till att bilden av endotelskiktet är tillräckligt fokuserad och tydlig för att möjliggöra noggrann offline analys, och att under det andra steget i analysflödet (post leukocyter bolus) att tillräckligt med tid finns kvar under tvättbufferten fas innan inspelningen återupptas för att säkerställa attalla icke-vidhäftande leukocyterna avlägsnats. Likaså är det viktigt att använda endotelceller i ett monolager av lämplig densitet för att förhindra förlust av celler som kan störa flödesmönster i trånga kapillärer och även kan vara svåra att skilja från större vidhäftande leukocyter enligt faskontrastmikroskopi. Vi har beskrivit optimal seedning densitet för mänskliga leversinusformade endotelceller, men kan variera mellan olika endothelial populationer och arter. Betydande framsteg har gjorts i att studera leukocyt rekrytering i djurmodeller med intravital mikroskopi. Den stora fördelen med vidhäftningen flödesanalysförfarande är att leukocyt-rekrytering kan studeras i ett binärt system med primära humana endotelceller. Vidare kan dessa interaktioner studeras under fysiologiska relevanta nivåer av skjuvpåkänning. Det är viktigt att bekräfta resultaten av intravital studier på djur med humana cellulära system eftersom det kan finnas skillnad näres i endothelial egenskaper mellan arter. En av begränsningarna i analysflödet är att leukocyter rekryteringen studeras i en encellig miljö endothelial monolager. Förutom när leukocyter har följt och transmigrated över endotelet de inte kan vara i närvarande i tillräckligt antal för att isoleras och utsätts för nedströmsprocesser. Trots dessa begränsningar, när vidhäftningen flödesanalysen har bemästrat den kan utvecklas för att utföra ytterligare analys av leukocyt vidhäftning kaskad och anpassad för att sammanfatta en flercellig miljö. Långvarig inspelning av enstaka fält och användning av mjukvara kan användas för att analysera krypande beteende leukocyter. Dessutom efter slutförandet av analysflödet de microslides kan förhöras med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi och immunofluorescens märkning för att studera adhesion och migration mer i detalj. Dessutom har vi tidigare utvecklaed en in vitro-modell där flödande leukocyter skulle kunna interagera med det hepatiska endotel rade genom förekomsten av hepatocyter. Denna analys kan också utvecklas för att studera subpopulationer av leukocyter: vår grupp har utfört studier med undergrupper såsom regulatoriska T-celler, B-celler och lever infiltrerande leukocyter. Dessa studier är bevis för att vidhäftningen flödesanalysen är ett kraftfullt verktyg för att studera allmänna och organspecifika leukocyt rekrytering i mänskliga system.

Det är nu väl etablerat att leukocyter rekrytering i allmänhet följer ett paradigm för den flerstegs vidhäftning kaskad 1. Detta involverar infångning av leukocyter från att strömma blod av endotelceller som bekläder kärlväggen. Inledningsvis leukocyter genomgå en rullande steg som förmedlas av selektin receptorer eller medlemmar av immunoglobulinsuperfamiljen. Detta gör G-proteinkopplade receptorer (GPCR) som uttrycks på leukocyter yta för att aktiveras av kemokiner som presenteras på den endoteliala glykokalyx. Detta leder till förändring av grin bekräftelse till en &quot;hög affinitet&quot; tillstånd på leukocyt ytan och arrestera och fast vidhäftning till endotelet. Firm vidhäftning följs sedan av formförändringar och genomsökning av leukocyt på fartyget. Det sista steget är transmigration genom endothelial monolager, vilket kan ske via paracellulär eller transcellulär vägar. Medan den flerstegs vidhäftning kaskad beskrivas allmänna mekanismen för leukocyt rekrytering i kroppen finns det organspecifika skillnader. I levern majoriteten av leukocyter rekrytering inträffar inom de hepatiska sinusvågor, i motsats till andra organ där rekrytering uppträder i allmänhet inom de postkapillära venoler 2. De leversinuskurvor är en låg skjuvning miljö och leukocyter genomgår en kort tjudra steg före fast adhesion som selektin oberoende 2. Dessa kanaler är kantade av det hepatiska sinus endotelet som är diskontinuerlig och innehåller fenestrae, öppna porer 100-200 nm i diameter, och saknar ett basalmembran 3. Klargöra de molekylära mekanismer som förmedlar leukocyt rekrytering över mänsklig leversinus endotel kunde identifiera organspecifika terapeutiska mål för inflammatoriska leversjukdomar. Flödesvidhäftnings analyser är viktiga verktyg i att studera leukocyt rekrytering. De tillåter återuppbyggnaden av leukocyt recruitment i närvaro av skjuvspänning för att analysera vidhäftning under väl definierade krafter. Den vanligaste användningen för analysen är studiet leukocyt adhesion till odlade endoteliala monoskikt eller renade substraten. Kommersiellt tillgängliga flödeskammare används för att BEGJUTA celler under förhållanden med laminärt flöde mellan två plana ytor och sedan visualisera den dynamiska processen för vidhäftning på ett mikroskop 4. Tidigare grupper har visat att vissa lim interaktioner bara ske under flöde och kan inte studeras i statiska analyser 5,6. Vi har använt denna teknik för att sammanfatta de lever sinusoider och studera leukocyt rekrytering under förhållanden med låg skjuvspänning. Primär human Hsec odlas i microslides och leukocyter kan därefter perfusion över detta monoskikt vid en flödeshastighet beräknas för att återge den skjuvspänning inom hepatic sinusoids. Skjuvspänningen är en stress som tillämpas parallellt eller tangerar en yta som opposed till normalspänning, som är vinkelrät. Varje vätska som rör sig längs en gräns kommer att utöva en skjuvspänning på denna gräns. Shear stress har visat sig vara en viktig del av lymfocyter transmigration 7. Under dessa förhållanden är varje steg av vidhäftning kaskad kan visualiseras genom faskontrastmikroskopi. Denna metod har gjort det viktiga insikter i rekryteringen av leukocyter i levern inklusive studiet av konventionella adhesionsmolekyler 8, rollen av kemokiner och kemokinreceptorer 9-11, och atypiska adhesionsmolekyler, såsom vaskulär adhesion protein-1 (VAP-1 ) 8,12 och gemensam lymfatisk och vaskulär endotel receptor-1 (CLEVER-1) 13. Även denna analys har nämnts i flera av vår grupps publikationer har sin beskrivning varit korta och vi har tagit tillfället i akt att ge en detaljerad steg för steg guide för att hjälpa till vid felsökning och förebygga tekniska fel vid försökning vid analysen. Dessutom har vi nyligen bytt inköp av Microkammare som möjliggör exakta förändringar i skjuvspänning. Vi tror att detta breddar tillämpningen av analysen för att andra endoteliala och immunceller. Följande metod beskriver förberedelserna och tekniken för att utföra en flödesbaserad vidhäftningsanalys med humana leversinusformade endotelceller och perifera blodlymfocyter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

Leucocyte infiltration i human levervävnad är en gemensam process i alla vuxna inflammatoriska leversjukdomar. Kronisk infiltration kan driva utvecklingen av fibros och progression till cirros. Att förstå de molekylära mekanismer som förmedlar leukocyt rekrytering till levern kunde identifiera viktiga terapeutiska mål för leversjukdom. Nyckel interaktion under leukocyt rekrytering är det av inflammatoriska celler med endotel under förhållanden av skjuvspänning. Rekryteringen till levern sker inom de låga skjuvning kanaler lever sinusoider som kantas av leversinusformade endotelceller (Hsec). Villkoren inom lever sinusoider kan rekapituleras genom perfusion leukocyter genom kanaler kantade av humana Hsec monolager vid specifika flöden. Under dessa betingelser leukocyterna undergå en kort tjudra steg följt av aktivering och fast vidhäftning, följt av en krypande steg och efterföljande transmigration över endotelskiktet. Med hjälp av faskontrastmikroskopi, kan varje steg i denna &quot;vidhäftning kaskad&quot; visualiseras och registreras därefter offline analys. Endotelceller och leukocyter kan förbehandlas med hämmare för att fastställa betydelsen av specifika molekyler under denna process.

Denna analys har förmågan att visualisera stegs vidhäftning flödes kaskaden och belysa de bakomliggande molekylära mekanismerna genom att jämföra resultaten av kontrollexperiment till de med molekylära inhibitorer. Olika kärlbäddar kan rekapituleras genom att införa särskilda endotelceller och förändra skjuvspänning förhållanden. Varje steg i vidhäftnings kaskaden kan analyseras offline genom att följa inspelningsmetod som beskrivs i protokollet. Det första steget av vidhäftning kaskad är rullning av leukocyter som kan uttryckas som en procentandel av det totala antalet vidhäftande celler. Offline analys tillåter antalet vidhäftande celler som skall räknas upp i varje inspelad fältet under leukocyt bolus. Uppspelning av bilden tillåter jämförelse av celler som är fast förbunden och de som genomgår en rullande rörelse genom endotelet. Rullande rörelse kan visualiseras med användning av denna teknik, är varje område registreras under minst 10 sek. Rullande celler identifieras genom deras reducerade hastighet över endotelytan jämfört med strömmande celler. Detta beteende måste visas under minst 5 sekunder utan avskildhet. Vidhäftningen kaskad inom de hepatiska sinusvågor sker i en låg skjuvning miljö och in vivo-studier har bekräftat minimal rullning med endast en kortfattad tjudra steget. Vi har bekräftat att analysflödet speglar miljön i de lever sinusoids genom att visa att färre än 10% av vidhäftande leukocyter ständigt rulla över stimulerad Hsec i dessa analyser. I nästa steg av vidhäftning kaskad är fast vidhäftning. Totalt följsamhet kan beräknas från den andra etappen av inspelning under tvättbuffert bolus (steg 7,3). Offline analys medger det totala antalet starkt adherenta celler som skall räknas i varje fält (figur 5). Starkt adherenta celler är definierade som celler som är stationär eller shapechanged med långsam krypande beteende.Det genomsnittliga antalet celler per fält kan sedan beräknas. Denna siffra kan sedan användas i kombination med den totala ytarean av synfältet (bestämd med användning av en streckplatta eller motsvarande), koncentrationen av lymfocyter (typiskt 1 x 10 6 celler / ml) och flödeshastigheten för att uttrycka graden av lymfocyter vidhäftning som vidhäftande celler / mm 2/10 6 celler perfusion. Att studera mönstret av vidhäftningen innebär en analys av de två sista stegen i vidhäftnings kaskad inklusive form-förändring, krypa och transendotelial migration. Leukocyter anhängare till den övre ytan av Hsec cellslager verkar fas-ljus, medan de som har migrerat genom monolagret verkar fasen mörk (Figur 6). Cellerna kan sedan klassificeras som uppvisar &quot;statisk&quot; adhesion (nonmigrated / rund), &quot;form-ändras&quot; morfologi eller som &quot;migrerat&quot; och de enskilda kategorierna sedan uttryckt i procent avtotal lim befolkningen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Figur 1. Monolager av primära humana hepatiska sinusformade endotelceller inom flödeskammare. A) Microslides fyllda med media som innehåller monolager av endotelceller före inledningen av flödesvidhäftningsanalys. B) Fas kontrastbild av sammanflytande endothelial monolager, bör endotelceller seedas i mikros som har förbelagda (för humana hepatiska endotelceller detta bör vara med råtta svans kollagen typ 1) och det är viktigt att endotelcellerna är friska i kultur och sammanflytande. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. Flödesanalyskammaren. En analysflödeskammare set-up kan ses här, består den av en transparent kammare, som är monterad på ett inverterat mikroskop. En uppvärmningsanordning är placerad i kammaren och bör termostatreglerad för att bibehålla en temperatur av 37 ° C. Det bör finnas tillgängliga portarna för att ansluta silikonslangar från en mikros inuti kammaren till en sprutpump som är belägen utanför. Den Micro placeras direkt på mikroskop scenen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> Figur 3. Sprutpump. En sprutpump är att anslutaed via silikonslang till flödet kammaren. Pumpen är inställd på en viss tillbakadragande hastighet beroende på önskad skjuvspänningen krävs för analysen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> Figur 4. Anslutning av ventil flödar kammare. A) En elektronisk magnetventil möjliggör växling mellan två sprutcylindrarna som innehåller antingen celler eller media med praktiskt taget inga döda utrymme. B) När ventilen spolas och de två tunnor sätts upp, silikonslangen från ventilen är ansluten till flödeskammaren. Det är kritiskt att vid anslutning av adaptern på silikonröret till porten på flödet kammaren finns det en vätske / vätske-gränsytan. &lt;a href = &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicka här för att visa en större bild. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> Figur 5. Mätning av total leukocyter vidhäftning. Under de sista två minuterna av tvättbuffert bolus steg (som beskrivs i protokollet), ska registreras minst tio slumpmässiga områden. Dessa kan analyseras off-line och det totala antalet fast vidhäftande celler kan räknas i varje fält. Total vidhäftning av leukocyter kan jämföras mellan kontrollkammare och de som förbehandlats med blockerande antikroppar, här visar vi en representativ fält från en kontroll bild och en bild förbehandlats med intracellulär adhesionsmolekyl-1 (ICAM-1) blockerande antikropp. Pilar har lagts till för att belysa de vidhäftande leukocyter, i representativativa fält från kontroll slide finns det totalt 25 leukocyter identifierats och i ICAM-1 block slide finns det totalt 13 leukocyter identifierats. Skala barer = 100 ìm. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> Figur 6. Analys av mönster av leukocyt-vidhäftning på endoteliala monoskikt genom faskontrastmikroskopi. Offline analys av registrerade områden kan också användas för att studera den riktning och hastighet hos leukocyt adhesion. Särskilda steg i vidhäftnings kaskad kan visualiseras och kvantifieras med hjälp av faskontrast avbildning. Fas ljusa celler som är ordentligt fastsittande men inte aktiverad kan betecknas &quot;runda&quot; adhesion, de celler som är aktiverad och fas ljus kan kallas &quot;form förändrats&quot; och de celler som är fas mörka är de celler som genomgått transendotelial migration och kan betecknas &quot;migrerat&quot;. Bilden visar exempel på varje mönster av vidhäftning. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress at JoVE.com

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte rekrytering till levern sker inom de specialiserade kanaler lever sinusoider som är kantade av unika hepatiska sinusformade endotelceller. Faskontrastmikroskopi av leukocyt rekrytering över mänsklig leversinus endotel under förhållanden av fysiologiska skjuvspänning kan underlätta att klarlägga de molekylära mekanismer som ligger bakom denna process.

En Flow Vidhäftning analys för att studera Leucocyte Rekrytering till Human lever Sinus Endothelium under förhållanden av skjuvspänning

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Imaging Leukocyte Vidhäftning till det vaskulära endotelet på High intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering av humana navelvenendotelceller och deras användning i studier av neutrofilinhibitorfaktor Transmigration Under flödesförhållanden

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Ett<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera skillnader mellan de mänskliga makrofagdifferentiering och polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Humant neutrofilt flöde kammare Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statisk vidhäftning analys för studier av Grin Aktivering i T-lymfocyter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel och snabb protokoll till icke enzymatiskt dissociera Färska mänskliga vävnader för analys av lymfocyter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro och in vivo modell för att studera bakteriell vidhäftning till kärlväggen Under Flow Villkor

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...