Name: isolation of cancer stem cells from human prostate cancer samples
Uploaded: 2014-03-14T18:32:00
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Este trabalho foi financiado pela Fundação Hariri Família e da Fundação TJ Martell.

1. Colheita e Processamento de tecido de câncer de próstata humano de espécimes cirúrgicos <ol><li> Preparar dois tubos cónicos de 50 ml de poliestireno que contêm 15 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Pessoal de serviço de Patologia colher amostras primários e metastáticos de câncer de próstata de prostatectomia e cirurgia paliativa espécimes, respectivamente, no âmbito de um Conselho de Revisã...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+impact,+heterogeneity,+and+uncertainty.">Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty.</a> Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).</li><li>Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+evolving+concept.">Cancer stem cells: an evolving concept.</a> Nat. Rev. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Res. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells.">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer Cell. 22, 373-388 (2012).</li><li>Patrawala, L., Calhoun-Davis, T., Schneider-Broussard, R., Tang, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+organization+of+prostate+cancer+cells+in+xenograft+tumors:+the+CD44+alpha2beta1++cell+population+is+enriched+in+tumor-initiating+cells.">Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells.</a> Cancer Res. 67, 6796-6805 (2007).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PSA(-/lo)+prostate+cancer+cell+population+harbors+self-renewing+long-term+tumor-propagating+cells+that+resist+castration.">The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration.</a> Cell Stem Cell. 10, 556-569 (2012).</li><li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2013.">Cancer statistics, 2013.</a> CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+purified+CD44++prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells.">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li></ol>

Este protocolo descreve o isolamento das CSCs de fresco tecidos de cancro da próstata humano. Várias considerações importantes influenciam o sucesso deste protocolo. A recuperação de um elevado número de células cancerosas da próstata viáveis ​​depende de avaliação cuidadosa bruta de amostras cirúrgicas. Em nossa experiência, o isolamento de células prostáticas tumorais é melhor assegurada quando nódulos tumorais macroscópicas são observados e tratados 10. ...

Heterogeneidade intratumoral é considerado uma indicação do cancro 1. De facto, vários mecanismos de heterogeneidade intratumoral foram descritas, incluindo a mutação genética e interacções com o microambiente. Além disso, alguns tipos de cancro podem conter uma hierarquia celular com uma sub-população de células estaminais de cancro (CSCs) que exibe as propriedades de capacidade de iniciação do tumor e de auto-renovação em ensaios de transplante em série 2-5. Inicialmente descrito em hematológica 6, 7 de mama, cérebro e 8 malignidades, CSCs também têm sido estudadas em cancro da próstata 9-12, bem como outros tipos de tumor de 2-5. CSCs são geralmente considerados uma fracção celular dentro de uma população heterogénea de 2-5. Portanto, a caracterização funcional e molecular de CSCs depende seu enriquecimento de populações em massa. Assim, durante as últimas duas décadas vários conheceuhodologies de CSC enriquecimento foram concebidas que normalmente envolvem a separação de populações marcados por citometria de fluxo. Além disso, uma consideração importante no estudo da CSCs é que a organização hierárquica de tecidos humanos pode ser interrompido por meio de manipulações experimentais, tais como passagens em série em cultura ou imunodeficientes ratinhos. Como resultado, o isolamento directo de CSCs de tecidos humanos tem emergido como uma importante metodologia no campo CSC. O câncer de próstata é uma das principais causas de morbidade e mortalidade nos Estados Unidos e ao redor do mundo 13 de câncer. Assim, o isolamento e caracterização biológica da CSCs próstata é de interesse significativo. CSCs próstata tenham sido previamente enriquecido a partir de linhagens de células derivadas de pacientes, xenotransplantes e baixa passagem pacientes provenientes de culturas em suspensão 9,10,12,14. Recentemente, relatou o isolamento de CSCs próstata diretamente de s cirúrgicos humanosplos em virtude de sua HLAI negativo da superfície celular fenótipo 10. Aqui detalhamos os procedimentos implementados para o isolamento dessas células. Tumores da próstata são colhidas a partir de amostras cirúrgicas e feito em suspensões de células. As células são depois coradas utilizando anticorpos contra HLAI assim como marcadores estromais e de viabilidade, e CSCs são isoladas por separação de células activadas por fluorescência (FACS). Isolado CSCs podem então ser utilizadas para ensaios que exigem células viáveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">RPMI</td>
			<td style="width:195px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:187px;">11875-093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:195px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:187px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:187px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning cell gro</td>
			<td style="width:187px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">60 mm-15 mm cell culture dish</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:187px;">3295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">35 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td style="width:195px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">50 ml conial tube</td>
			<td style="width:195px;">Crystalgen</td>
			<td style="width:187px;">23-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">15 ml conical tune</td>
			<td style="width:195px;">Crystalgen</td>
			<td style="width:187px;">23-2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Red blood cell lysing buffer</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HLA class I (W6/32) PE antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:187px;">ab43545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">CD31 FITC antibody</td>
			<td style="width:195px;">ebioscience</td>
			<td style="width:187px;">11-0319-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">CD45 FITC antibody</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:187px;">ab27287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">IgG2a&#954; PE antibody</td>
			<td style="width:195px;">BD Pharminogen</td>
			<td style="width:187px;">555574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">IgG1&#954; FITC antibody</td>
			<td style="width:195px;">BD Pharminogen</td>
			<td style="width:187px;">551954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DAPI</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:187px;">d3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:195px;">BD Falcon&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:187px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Vortex Mixer</td>
			<td style="width:195px;">Crystalgen</td>
			<td style="width:187px;">CG-BV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">10% Neutral Buffer Formalin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:187px;">RBBP-0480</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cancer stem cells from human prostate cancer samples

O modelo de células-tronco do câncer (CSC) tem sido revisitado consideravelmente ao longo das últimas duas décadas. Durante este tempo os CSCs foram identificados e isolado directamente a partir de tecidos humanos e em série propagados em ratinhos imunodeficientes, normalmente por meio de marcação de anticorpos de subpopulações de células e de fraccionamento, por citometria de fluxo. No entanto, as características únicas clínicos de cancro da próstata tem limitado consideravelmente o estudo das CSCs da próstata a partir de amostras de tumores humanos frescos. Recentemente, referiram o isolamento de CSCs próstata directamente a partir de tecidos humanos, em virtude da sua classe I HLA fenótipo (HLAI)-negativo. Células de câncer de próstata são colhidas a partir de espécimes cirúrgicos e dissociados mecanicamente. A suspensão de células é gerada e marcada com anticorpos HLAI e estromais conjugados fluorescentes. As subpopulações de células HLAI-negativos são finalmente isolados utilizando um citómetro de fluxo. A principal limitação deste protocolo é a natureza muitas vezes microscópica e multifocal decâncer primário em espécimes de prostatectomia. No entanto, isolados CSCs próstata ao vivo são adequados para a caracterização molecular e validação funcional por transplante em ratos imunodeficientes.

<img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51332/51332fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51332/51332fig1.jpg" /> Figura 1. Próstata humana colheita tumor de câncer e citometria de fluxo enredo ilustrando populações específicas de um câncer de próstata humano. (A) nódulos tumorais são colhidas para gerar uma suspensão celular. Teor de tumor da amostra processada é confirmada usando hematoxilina e eosina convencional. <st...

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Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

O isolamento de células-tronco cancerosas (CSCs) diretamente a partir de tecidos humanos é requisito para a sua caracterização biológica. Este manuscrito descreve uma metodologia para o isolamento de CSCs próstata de tecidos humanos, além de fornecer dicas sobre solução de problemas etapas difíceis.

Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

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