Name: harmonic nanoparticles for regenerative research
Uploaded: 2014-05-01T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research at JoVE.com

Los autores desean agradecer la financiación parcial del Proyecto de Investigación FP7 NAMDIATREAM Europea (NMP4-LA-2.010-246479, http://www.namdiatream.eu) y el proyecto INTERREG IV Francia-Suiza NAOMI.

1. Cultura y Ampliación de ESC Humano <ol><li> Preparar el medio de propagación de células (llamado PM) que contiene Knockout DMEM suplementado con 20% suero Knockout, 1% MEM ácidos no esencial amino, 1% de L-glutamina 200 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, y 3,5 l β-mercaptoetanol. </li><li> Descongelar ESC humana (células madre) en 8 ml de medio PM y los centrifugar 5 min a 115 xg para descartar medio de congelación DMSO-complementado. </li><li> Añadir 1 ml de PM medio que contiene 10 mM de inhibidor de la...

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	<li>Bonacina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+Fe(IO3)3+nanocrystals+as+local+probes+for+nonlinear+microscopy.">Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy.</a> Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).</li><li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+nanowire+nonlinear+optical+probe.">Tunable nanowire nonlinear optical probe.</a> Nature. 447, 1098-1101 (2007).</li><li>Aufray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthesis+of+Nanosized+Niobium+Oxides+and+Lithium+Niobate+Particles+and+Their+Characterization+by+XPS+Analysis.">New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis.</a> J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).</li><li>Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+harmonic+holographic+microcopy+using+nanoparticles+as+probes+for+cell+imaging.">Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging.</a> Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).</li><li>Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength+dependent+damage+in+biological+multi-photon+confocal+microscopy:+A+micro-spectroscopic+comparison+between+femtosecond+Ti+:+sapphire+and+Cr+:+forsterite+laser+sources.">Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources.</a> Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).</li><li>Ferreira, L., Karp, J. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+series+of+small+indium+arsenide-zinc+selenide+core-shell+nanocrystals+and+their+application+to+in+vivo+imaging.">Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging.</a> J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).</li><li>Vallee, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-based+cardiopatches+improve+cardiac+function+in+infarcted+rats.">Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).</li><li>Idris, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+transplanted+cells+in+live+animal+using+upconversion+fluorescent+nanoparticles.">Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles.</a> Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).</li><li>Haase, M., Schafer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upconverting+nanoparticles.">Upconverting nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Upconversion+Nanoparticles+for+Dual-Modal+Imaging-Guided+Stem+Cell+Therapy+under+Remote+Magnetic+Control.">Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control.</a> Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).</li><li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two-photon+microscopes.">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li></ol>

La aplicación de la nanotecnología a la investigación con células madre es una disciplina relativamente nueva, pero en rápida expansión campo. Como se ha señalado por varios artículos de revisión sobre el tema, el uso de nanopartículas se puede aplicar para llevar a cabo diferentes tareas de investigación, que van desde celular de seguimiento (tanto in vitro como in vivo), para el suministro intracelular de proteínas y genes, no menos importante la creación de entornos celulares biomiméti...

Sistemas de microscopía no lineal, gracias a sus tres capacidades de seccionamiento dimensionales inherentes, han provocado cada vez más la demanda de fluoróforos foto-estable con bandas de absorción de dos fotones del infrarrojo cercano. Sólo en el último par de años, para complementar el desarrollo de etiquetas basadas en la fluorescencia (colorantes, puntos cuánticos, up-conversión de nanopartículas), una metodología diferente de imágenes ha estado explotando el uso de una nueva familia de nanopartículas inherentemente no lineales como etiquetas, es decir, nanopartículas de armónicos (HNPs) que se han desarrollado específicamente para la microscopía de múltiples fotones. Estas etiquetas, basadas en cristales noncentrosymmetric inorgánicos, ejercen contraste óptico que genera el SH de la frecuencia de excitación, por ejemplo mediante la conversión de una fracción de la luz cercana al infrarrojo excitación pulsada (λ = 800 nm) en luz azul visible (λ / 2 = 400 nm) . Varios autores en los últimos años han probado diferentes materiales, incluyendo yodato de hierro Fe (IO <sub&gt; 3) 3 1, niobato de potasio (KNbO 3) 2, niobato de litio (LiNbO 3) 3, titanato de bario (BaTiO3) 4,5, fosfato de potasio titanilo (KTiOPO4, KTP) 6-8, y óxido de zinc (ZnO ) 5,9,10. En comparación con las sondas fluorescentes, HNPs poseen una serie de propiedades atractivas, tales como la ausencia completa de blanqueo y parpadear, bandas de emisión estrechas, capacidad de ajuste de excitación de longitud de onda (desde el ultravioleta al infrarrojo), la capacidad de recuperación de la orientación, y la respuesta óptica coherente. Estas propiedades únicas se han explicado recientemente en dos artículos de revisión exhaustivos 11,12. La posibilidad de trabajar en la región espectral infrarroja, que aumenta la profundidad de formación de imágenes, reduciendo al mínimo la dispersión y absorción, también limita drásticamente la degradación foto de la muestra 13,14. Por otra parte, la señal de la foto estables infinitamente garantizada por HNPs los convierte en ideales para las sondas de rastreo celular a largo plazo, que is especialmente atractivo para aplicaciones de medicina regenerativa 15. En este experimento se visualizó, detalles del protocolo se proporcionan para marcaje in vitro de las células madre embrionarias humanas (CMEH) con HNPs no funcionalizados. La síntesis y preparación de suspensiones coloidales se detalla en una publicación anterior, y en las referencias allí 16 y está más allá del alcance de este trabajo. Se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacos (mantenidas como cultivos al aire líquido a largo plazo). ESC humana se puede dejar para diferenciar dentro de los llamados cuerpos embrioides (EBS) en dos formas diferentes, ya sea por la formación de EB de fragmentos de colonias en suspensión o, alternativamente, la agregación de células individuales en EBS utilizando la placa de Aggrewell forzados, como se ilustra en la Figura 1A . El cultivo de vencer a grupos de células cardiacas en politetrafluoroetileno (PTFE) filtros porosos FACilitates su mantenimiento a largo plazo para estudios posteriores (por ejemplo, las mediciones electrofisiológicas de los potenciales de acción). La fuente de excitación de la microscopio de barrido debe ser capaz de entregar pulsos ultracortos (con una duración de pulso menor que 300 fs a la muestra) a fin de alcanzar la potencia de pico necesaria para realizar la imagen con segundo armónico de HNPs. Por ejemplo, el fs-fuente más común utilizado para la formación de imágenes son sintonizables Ti: láseres de zafiro. Alternativamente, otros láseres ultrarrápidos pueden emplearse, por ejemplo iones de erbio 17, forsterita cromo 18 o Ti: zafiro bombeado infrarrojos osciladores paramétricos ópticos. El microscopio puede estar equipado con un objetivo con una apertura numérica preferentemente bastante alto. Muy importante, antes de las medidas, y cada vez que el objetivo se sustituye, es obligatorio para reducir al mínimo la dispersión presente en el set-up (lentes) mediante la optimización de la configuración de la pulso de láser pre-compresor en el trabajolongitud de onda de la elección. Este procedimiento, se detalla en el protocolo, se asegura de que el pulso de láser es tan cerca como sea posible a la transformación duración limitada (es decir, más corta como sea posible) en el plano focal y maximiza la respuesta de muestra no lineal. El objetivo del análisis de la imagen se describe al final del protocolo es identificar y realizar un seguimiento de los movimientos en 3D HNPs asociados con las contracciones rítmicas de vencer grupos cardíacas. Nanopartículas de seguimiento en el plano de la imagen es simplemente dieron cuenta mediante la identificación de sus posiciones en los sucesivos fotogramas de película. Para extraer información sobre el movimiento axial, una calibración previa de la respuesta no lineal de intensidad como una función del desplazamiento axial es obligatorio. Tenga en cuenta que para las mediciones a largo plazo, un control interferométrico activa de la posición axial de la muestra se requiere para mantener la validez de la curva de calibración, en presencia de derivas térmicas y / o mecánicos. Los HNPs utilizados aquí para traccélulas e latiendo dentro de los agregados están basados ​​en óxido de niobato de potasio (KNbO 3), pero otros nanomateriales no lineales disponibles son revisados ​​en detalle en la obra de Staedler et al 16. Las eficiencias ópticas no lineales de la mayoría de los nanomateriales investigadas hasta ahora son muy comparables. La elección de KNbO 3 fue motivado esencialmente por la buena estabilidad de la solución coloidal y su buena biocompatibilidad, probado en varias líneas celulares humanas incluso en concentración bastante alta y tiempos de exposición largos 16. Dada la novedad del nanomaterial empleado para este trabajo, las principales características de HNPs en comparación con / luminiscentes bio-marcadores fluorescentes se muestran en un vídeo de animación de ordenador original corto realizado por los autores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Microscope Incubator</td>
			<td style="width:231px;">OKO LAB</td>
			<td style="width:205px;">UNO package (top stage)</td>
			<td style="width:343px;">&#160;37&#176;C, 5% CO2, moisturized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="2" style="height:64px;width:231px;">Multiphoton microscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td rowspan="2" style="width:205px;">AR1-MP</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:343px;">Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Filters SHG and autofluorescence</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Semrock</td>
			<td style="width:205px;">FF01-360/12-25</td>
			<td rowspan="3" style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FF01-395/11-25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">FF02-485/20-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Microscope objectives</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td style="width:205px;">CFI Plan Fluor 10x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.30, WD 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">CFI Plan Apo 20x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">CFI Apo 40x</td>
			<td style="width:343px;">NA 1.25, WD 0.18mm &#955;S, Nano-Crystal Coat</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Rhock inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">Y-27632</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10829</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Knockout Serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10828</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">1140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">L-glutamine 200mM&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">25030</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">15140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">M7522</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Collagenase IV&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">17104-019</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Roller scraper tool&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemPro EZPassage, Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">23181-010</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">StemPro Accutase&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">S11105-01</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Aggrewell system&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:205px;">27845</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Hyclone serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Gelatin</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">G9391</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">6-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:205px;">353046</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">24-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Nunclon</td>
			<td style="width:205px;">142475</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters</td>
			<td style="width:231px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:205px;">NA76/25</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Inserts</td>
			<td style="width:231px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">PICM03050</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harmonic nanoparticles for regenerative research

En este experimento se visualizó, detalles del protocolo se proporcionan para marcaje in vitro de las células madre embrionarias humanas (CMEH) con nanopartículas de generación de armónicos segundo (HNPs). Estos últimos son una nueva familia de sondas introducidas recientemente para el etiquetado de las muestras biológicas para imágenes multi-fotón. HNPs son capaces de duplicar la frecuencia de la luz de excitación por el proceso óptico no lineal de generación de segundo armónico sin restricciones en la longitud de onda de excitación. Multi-fotón metodologías para la diferenciación de células madre en grupos cardíacos (mantenidas como cultivos al aire líquido a largo plazo) en base se presentan en detalle. En particular, se muestra evidencia sobre cómo aprovechar al máximo el segundo armónico (SH) de emisión intensa de HNPs aisladas durante el control 3D de golpear el tejido cardíaco en 3D. El análisis de las imágenes resultantes para recuperar los patrones de desplazamiento en 3D también se detalla.

Antes de la evaluación de la actividad latidos por imagen confocal, se realizó una caracterización cuidadosa de la respuesta óptica no lineal de los filtros de PTFE, ya sea solo o en presencia de HNPs a alta concentración (1 mg / ml). Se aseguró de que: i) el sustrato desnudo de dos fotones de fluorescencia excitada es muy débil y no puede evitar que la medición de las muestras biológicas pertinentes, y ii) la emisión SH a partir de HNPs aislados puede ser fácilmente adquirido por formación de imágenes a tr...

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Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Armónica Nanopartículas para Regenerativa de Investigación

Detalles del Protocolo se proporcionan para etiquetado células embrionarias humanas in vitro madre con segunda nanopartículas que generan armónicos. También se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacas.

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

La construcción de un hidrogel de colágeno para la entrega de la madre microesferas cargadas con células quitosano

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Investigación

Bioingeniería

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Biofuncionalizadas prusiana nanopartículas azul para Multimodal Molecular Aplicaciones de imágenes

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Correlativa a la luz y microscopía electrónica de Uso de Quantum Dot nanopartículas

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Producción de nanopartículas metálicas por ablación por láser pulsado en líquidos: una herramienta para estudiar las propiedades antibacterianas de las nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

20 mJ, 1 ps Yb: YAG amplificador regenerativo de disco delgado

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...