Name: imaging plasma membrane deformations with ptirfm
Uploaded: 2014-04-02T16:30:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM at JoVE.com

Denne forskning er støttet af et nationalt Scientist Development Grant (13SDG14420049) til AA fra American Heart Association og startfonde fra Wayne State University. Vi står i gæld til Dr. Ronald W. Holz og Dr. Mary Bittner for at yde rådgivning vedrørende den bovine binyre præparater og Dr. Daniel Axelrod for assistance med pTIRFM opsætning og nyttige kommentarer til manuskriptet. Syt-1 pHluorin blev anvendt med tilladelse af Dr. Gero Miesenbock (University of Oxford). GCAMP5G blev opnået gennem Addgene. Vi takker James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman, og Praneeth Katrapti med hjælp til at optimere forskellige trin i de beskrevne måder.

1.. PTIRF systemopsætning Den pTIRFM teknik er bygget på et inverteret mikroskop platform. Laserstråler dirigeres gennem en side belysning port og en nonpolarizing sidevendte filter terning, og derefter fokuserede på bagsiden brændplan en 60X 1,49 NA TIRF mål. To ekstra linser (1,6 x og 2x) ​​i stien emission mellem mikroskop og EMCCD kamera give en endelig pixelstørrelse på ca 80 nm. Laserlys er styret ved hjælp af software-styrede galvanometer spejle til hurtig skift mellem epi-og total indre refleksion (TIR) ​​belysning. Den nedenfor beskrevne protokol forudsætter, at optik til TIRF allerede er på luft tabellen i de optimale positioner for fluoroforen excitation og billeddannelse. Den beskriver, hvordan polarisering optik føjes til en eksisterende TIRF mikroskop sat op til at muliggøre billeddannelse af cellemembran deformationer. En skematisk af vores laboratorium optiske set-up for at generere både TIR og polarization-baserede TIR er vist i figur 1A. Protokollen antager anvendelse af en 488 nm laser for excitation af fluorescerende vesikel proteiner, og en 561 nm laser til billeddannelse af carbocyanine farvestof, gjorde. <ol><li> Tænd alle mikroskop komponenter, lasere og computere. </li><li> At lede en stråle fra 488 nm laser til bagsiden brændplanet (BFP) i 1,49 NA linse som vist i figur 1A. Hvis laserstrålen er fokuseret på BFP, vil det vise kollimerede og fremstår som små veldefinerede plet på loftet direkte over målet. </li><li> Juster X galvanometeret spejl (spejlet placeret i den tilsvarende prøve flyet), så laserstrålen flyttes off-axis og kommer fra det mål på gradvis stejlere vinkler til målet normal. </li><li> Dernæst kontrollere, at TIR er opnået. Tilsæt 10 ul fluorescerende mikrosfærer til en 1 ml volumen af ​​PSS i et glas-bund fad. Kun fluorescens fra mikrosfærer på bunden of skålen, tættest på TIR interface, bør detekteres. Påvisning af flydende mikrosfærer angiver, at vinklen mellem det indfaldende lys og objektiv normalt er utilstrækkelig. Nedenstående afsnit beskriver opsætningen af ​​de optiske komponenter, der er nødvendige for polarisering-baserede imaging. </li><li> Brug af den linje 488 nm stråle som en guide, justere placeringen af ​​det rå 561 nm laserstråle, så det er på rejse langs en identisk optisk vej. 561 nm laser vil blive anvendt til billeddannelse af carbocyanine farvestof, gjorde. </li><li> Indsæt en divergerende linse og spejle nedstrøms for 561 nm laser. Ved hjælp af spejle, justere strålen, således at den coaligned med 488 nm stråle, og stedet er i fokus på loftet, når galvanometer spejle er i position &quot;0&quot;. </li><li> Center en kvartbølgeplade (QW) i strålegangen umiddelbart nedstrøms for laseråbningen. Brug en QW som enten er akromatisk eller tunet til excitationsbølgelængden.En QW vil cirkulært polarisere enhver lineært polariseret lys, som kommer ind ved en 45 ° vinkel med den optiske akse. Nogle optiske komponenter, såsom polarisering terninger, har en dæmpning bias i retning af en akse af polarisering. Den QW kan roteres for at kompensere for denne skævhed. Denne justering vil resultere i en elliptisk polariseret stråle. En QW er nødvendig, fordi laserstrålen selv er stærkt lineært polariseret (lodret), som det fremgår fra åbningen. </li><li> Placer en polarisering cube (PC1) neden for elliptisk polariseret stråle. Polariseringen terning afspejler den lodrette (y) komponent af det elektriske felt og passerer den vandrette (x) komponent. Polariseringen terning er placeret på en lille oversætte scenen for at lette den efterfølgende tilpasning af polarisering strålebaner. </li><li> Brug en anden polariserende cube (PC2) og spejle (figur 1A) til at rekombinere de bjælker. </li><li> Placer en lukkertid mellem den første polarisering cube (PC1) og den lodrette samarbejdemponent spejl. Placer en anden lukker mellem den horisontale komponent spejl og anden polarisering cube (PC2). Disse skodder styres af imaging software gør det muligt for brugeren til hurtigt at vælge mellem beam polariseringer. </li><li> Brug et polariserende filter til at kontrollere det elektriske felt orientering i hver strålegangen. En polariserende filter vil kun tillade transmission i overensstemmelse med filterets akse. </li><li> Kontroller, at de lodrette og vandrette komponenter af laserstrålen på linie med hinanden, og 488 nm stråle. Foretag de nødvendige justeringer. De tre bjælker bør alle være fokuseret på BFP og komme kollimeret fra målsætningen om at det samme sted på loftet. Denne stedet kan markeres med et X for at lette fremtidige linieføring. </li><li> Placer en dråbe immersionsolie på målsætningen. Skaalen med fluorescerende mikrosfærer (se trin 4 ovenfor) på målsætningen. </li><li> Indtast TIR ved at bevæge X-galvanometer spejl. I TIR, den lodrette component strålen S-pol og den horisontale komponent af strålen er nu p-pol. Juster den relative intensitet mellem bjælkerne ved at dreje QW plade. Se hver polariseret flygtige felt med en rhodamin prøve, som forventes at være tilfældigt orienteret. Drej QW plade, der passer til de gennemsnitlige pixel intensiteter. Hvis det er nødvendigt, tilføje et filter med neutral tæthed i en polariseret stråle sti at dæmpe sin intensitet. </li></ol> 2. Chromaffin Cell Isolation En procedure til at isolere sunde kromaffinceller fra kalven binyrerne findes nedenfor. Det er tilpasset fra tidligere offentliggjorte protokoller fra Wick, Senter et al. 19 og O&#39;Connor, Mahata et al. 20. Efter isolering celler elektroporeres med plasmid (r) af interesse ved hjælp af et elektroporation system. Dette system resulterer i 20-30% af celler, der udtrykker de ønskede fluorescerende proteiner. Typisk 70% af cellerne overlever de udvalgteroporation proces. Nærmere oplysninger om PSS og medier komponenter er tilvejebragt i tabel 2, 3, og 4. <ol><li> To dage før cellen prep, behandle 35 mm optisk kvalitet glasbund (0,17 mm tyk) retter med 1 ml poly-D-lysin (0,1 mg / ml) efterfulgt af 1,25 ml bovint collagen. Lad retter lufttørre i vævskultur hætte. </li><li> Opnå kvæg binyrerne fra slagteriet. Hold kirtler på isen, mens de transporteres tilbage til laboratoriet. De kvæg binyrerne kan være indkapslet i et tykt lag fedt. Brug kirurgiske saks for at fjerne overskydende fedt og afsløre adrenal vene åbning. Perfuse venen med prep-PSS gentagne gange, indtil den kirtel er renset for blod. </li><li> Dernæst langsomt afpipetteres 2 ml TH-PSS løsning ind i venen åbningen indtil kirtel dønninger. Inkubér oppustede kirtler ved 37 ° C i 15 min. Gentag TH-PSS behandling og inkuberes igen. </li><li> Skær gennem den ydre binyrebarken omkring kanten af ​​kirtlen med scissors og skræl kirtel fra hinanden for at eksponere medulla. Brug en skalpel til forsigtigt at skrabe og adskille medulla fra cortexvæv. </li><li> Hakke medulla med et par skalpelblade for 5-10 min. </li><li> En endelig spaltningstrinnet er nødvendigt at isolere individuelle kromaffinceller. Hæld hakket cellesuspension i en spinnerkolbe. Delvist fylde kolben med en 2:1 TH-PSS (30 ml) til TL-PSS (15 ml) og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, mens spinding ved omtrent 100 omdrejninger pr. </li><li> Adskil de enkelte kromaffinceller fra ufordøjet væv ved filtrering gennem en 400 um mesh. Filtratet opsamles. Centrifugeres ved 200 xg for at pelletere cellerne og resuspenderes i iskold PSS. </li><li> Filtreres celler gennem en 250 um mesh, pellet, og endelig resuspender i elektroporation puffer (se trin 2.9). </li><li> Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og forberede transfektion. </li><li> Transficere celler med elektroporation ifølgeproducentens anbefalinger. De præcise betingelser for elektroporation skal bestemmes empirisk. Bemærk: De indstillinger, som giver den bedste balance mellem transfektion effektivitet og celle overlevelse for denne forberedelse af kvæg kromaffinceller er 1.100 V, 40 ms, og 1 puls. Vi vurderer, at disse betingelser, er 20-30% af cellerne transficeret. Omkring 30% af cellerne overlever ikke elektroporation proces. </li><li> Plate celler forsigtigt på poly-D-lysin og collagen behandlet retter i 1 ml opvarmede elektroporere medier. </li><li> Placer retter i en 37 ° C inkubator (5% CO 2). Der tilsættes 1 ml 2x antibiotiske medier til hver skål efter 6 timer. Skift mediet normale medier den næste dag. </li><li> Kromaffinceller typisk afbildes 2-5 dage efter elektroporering. </li></ol> 3. pTIRF Image Acquisition <ol><li> Tænd imaging system og starte software. </li><li> Kontroller, at lasere er afstemt. Tjek flygtigefelt profil ved hjælp af mikrosfærer. </li><li> Forbered det globale og lokale perfusion system. Clean-rensevæske reservoirer med filtreret deioniseret H2O og fylde med basal og stimulerende PSS løsninger. </li><li> Før billeddannelse kromaffinceller kontrollere, at p-pol-og s-pol excitationer belyse den samme region i synsfeltet, og at belysningen intensiteter er nogenlunde tilsvarende. For at gøre dette, skal du udfylde et glas-bund fad med 2 ml PSS indeholder rhodamin ved en endelig koncentration på 10 mM. Sekventielt excite rhodamin prøven med p-pol og S-pol lys og fange billeder. I praksis P og S-emissioner fra DID normaliseres til middelværdien af ​​P og S rhodamin emissioner. Se billedet analyse og diskussion sektioner for yderligere detaljer. </li><li> Nu videre til farvning bovine kromaffinceller med gjorde. Skyl dyrkningsmedier fra fadet indeholder kromaffinceller og erstatte med 2 ml basal-PSS. Tilsæt 10 gl 10 mM gjorde (fortyndet i ethanol)direkte til skålen, der indeholder cellerne. Ryst forsigtigt skål for 2-10 sek og fjern DID + PSS løsning. </li><li> Vask fad 3-4x med basal-PSS for at fjerne eventuelle gjorde. Cellerne er nu farves og klar til brug. </li><li> Tilføj en dråbe immersionsolie til målet. Placer skål indeholdende DID-farvede kromaffinceller på toppen af ​​målet. </li><li> Visning skålen enten gennem målet eller på kameraet, finde en celle, der er transficeret med proteinet af interesse og farvet med gjorde. Et godt farvet celle udviser en P emission at levende fremhæver kanterne af cellen; S emission bør være nogenlunde ensartet over cellen fodaftryk (dvs. det område af cellen, der er klæbet til glasset og filmede i TIRF). </li><li> Placer lokal perfusion nålen, således at det er omtrent 100 um fra cellen. </li><li> Fokus på cellemembranen og aktivere autofokus hardware umiddelbart før celle stimulation / billede erhvervelse. &lt;/ Li&gt; <li> Begynd billede erhvervelse. Perfuse celler til 10 sekunder med en basal opløsning og derefter i 60 sekunder med en depolariserende 56 mM KCI-opløsning. Anskaf billeder, mens hurtigt forskalling mellem 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (at overvåge ændringer i P og S emission af gjorde) og 488 nm excitation (til billede transficerede vesikel probe). Eksempler på billeder opnået under forsøg er vist i figur 2 og figur 3. </li></ol> 4.. Image Analysis Beregninger for billedbehandling kan udføres med ImageJ, men udnytte scripts i et fleksibelt programmeringssprog som IDL eller Matlab kan i høj grad øge analyse gennemløb ved at automatisere opgaven. To typer af billeder skal beregnes for at få topologiske oplysninger fra rå emission billeder -. P / S og P +2 S P / S rapporterer lokale membran deformationer, mens P +2 S sum rapporter om den samlede membran farvestof i en bestemt regionaf feltet. <ol><li> Alle billeder skal være baggrund fratrækkes. Vælg en off-celle ROI måler den gennemsnitlige pixelintensitet i ROI, og derefter trække denne værdi fra alle pixels i billedet stakken. </li><li> Til beregning af P / S, opdele hver &quot;P&quot; emission rammen ved den efterfølgende &quot;S&quot; emission frame (pixel-til-pixel). P / S varierer med de relative intensiteter af p-og s-pol excitationer, skævheder i optiske system, og interferensbåndene. For at reducere disse effekter, normalisere P / S-forhold fra opnået fra DID emission til forholdet opnås med en opløsning indeholdende 10 mM rhodamine 18. </li><li> Exocytose af individuelle DCVs fremgår af en pludselig ændring i intensiteten af et fluorescerende vesikel protein, såsom synaptotagmin-1 pHluorin (figur 2B). Bestemme ændringer i P / S og P +2 S af gennemsnittet af pixel i en 240 nm radius ROI centreret over lokaliserede stigninger i P / Sratio på steder af exocytose. Når fusion forekommer uden en tydelig stigning i P / S, er ROI centreret over det område af fusing DCV. </li><li> Computersimuleringer kan udføres for at fortolke P / S og P +2 S membran intensitetsændringer i form af simple geometrier af en dilaterende fusion pore. For nærmere oplysninger om de simuleringer, se venligst Anantharam et al. 18. </li></ol>

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Membranes of the world unite! Cell Biol. 175, 201-207 (2006).</li><li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+synaptotagmin+trigger+neurotransmitter+release.">How does synaptotagmin trigger neurotransmitter release.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 615-641 (2008).</li><li>Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+and+its+role+in+membrane+fission.">Dynamin and its role in membrane fission.</a> Annu. Cell Dev. Biol. 16, 483-519 (2000).</li><li>Lang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-triggered+peptide+secretion+in+single+cells+imaged+with+green+fluorescent+protein+and+evanescent-wave+microscopy.">Ca2+-triggered peptide secretion in single cells imaged with green fluorescent protein and evanescent-wave microscopy.</a> Neuron. 18 (6), 857-863 (1997).</li><li>Steyer, J. A., Horstman, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells.">Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> Nature. 388, 474-478 (1997).</li><li>Allersma, M. W., Wang, L., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+regulated+exocytosis+with+a+granule-membrane+probe+using+total+internal+reflection+microscopy.">Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 4658-4668 (2004).</li><li>Toomre, D., Steyer, J. A., Keller, P., Almers, W., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+constitutive+membrane+traffic+with+the+cell+surface+observed+by+evanescent+wave+microscopy.">Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy.</a> J. Cell Biol. 149, 33-40 (2000).</li><li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li><li>Heinemann, C., Chow, R. H., Neher, E., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+secretory+response+in+bovine+chromaffin+cells+following+flash+photolysis+of+caged+Ca2.">Kinetics of the secretory response in bovine chromaffin cells following flash photolysis of caged Ca2.</a> Biophys. J. 67, 2546-2557 (1994).</li><li>Heidelberger, R., Heinemann, C., Neher, E., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dependence+of+the+rate+of+exocytosis+in+a+synaptic+terminal.">Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal.</a> Nature. 371 (6497), 513-515 (1994).</li><li>Chow, R. H., Klingauf, J., Heinemann, C., Zucker, R. S., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+determining+the+time+course+of+secretion+in+neuroendocrine+cells.">Mechanisms determining the time course of secretion in neuroendocrine cells.</a> Neuron. 16, 369-376 (1996).</li><li>Thompson, N. L., McConnell, H. M., Burhardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+in+supported+phospholipid+monolayers+detected+by+the+dichroism+of+fluorescence+excited+with+polarized+evanescent+illumination.">Order in supported phospholipid monolayers detected by the dichroism of fluorescence excited with polarized evanescent illumination.</a> Biophys. J. 46, 739-747 (1984).</li><li>Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+orientation+visualized+by+polarized+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence.</a> Biophys. J. 77, 2266-2283 (1999).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Feldman, M. E., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane+marker+leaves+synaptic+vesicles+in+milliseconds+after+exocytosis+in+retinal+bipolar+cells.">A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells.</a> Neuron. 35, 1085-1097 (2002).</li><li>Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+plasma+membrane+deformations+reveals+pre-fusion+membrane+curvature+changes+and+a+role+for+dynamin+in+the+regulation+of+fusion+pore+expansion.">Real-time imaging of plasma membrane deformations reveals pre-fusion membrane curvature changes and a role for dynamin in the regulation of fusion pore expansion.</a> J. Neurochem. , 10-1111 (2012).</li><li>Anantharam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+role+for+the+dynamin+GTPase+in+the+regulation+of+fusion+pore+expansion.">A new role for the dynamin GTPase in the regulation of fusion pore expansion.</a> Mol. Biol. Cell. 22, 1907-1918 (2011).</li><li>Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+TIRFM+reveals+changes+in+plasma+membrane+topology+before+and+during+granule+fusion.">Polarized TIRFM reveals changes in plasma membrane topology before and during granule fusion.</a> Cell Mol. Neurobiol. 30, 1343-1349 (2010).</li><li>Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+topological+changes+of+the+plasma+membrane+upon+exocytosis+visualized+by+polarized+TIRFM.">Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM.</a> J. Cell. 188, 415-428 (2010).</li><li>Wick, P. W., Senter, R. A., Parsels, L. A., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+studies+of+secretion+in+bovine+chromaffin+cells+and+PC12+cells:+generation+of+kainate-sensitive+chromaffin+cells.">Transient transfection studies of secretion in bovine chromaffin cells and PC12 cells: generation of kainate-sensitive chromaffin cells.</a> J. Biol. Chem. 268, 10983-10989 (1993).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1248-1253 (2007).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Polarisering-baserede TIRFM registrerer hurtige, submikroskopisk ændringer i membran topologi. Gennemførelse af teknikken er forholdsvis ligetil, især hvis TIRF optik er allerede på plads. Alt hvad der behøves er et kvartbølgeplade to polariserende terninger, og skodder til at adskille p-pol-og s-pol belysning stier. Den nøjagtige position af disse komponenter på bordet er normalt dikteret af plads. For at få membran topologiske oplysninger bør den fluorescerende probe anvendte interkalere med en fast eller kendt orientering. Den teknik, som beskrevet i denne artikel, forudsætter brugen af carbocyanine farvestoffer men andre farvestoffer, såsom FM1-43 14, kan også anvendes. Membranen farvning selve proceduren er ligetil. Dyrkede celler kræver kun en meget kort eksponering (mindre end 10 sek) til en lille mængde dil / gjorde for at opnå overstrømmende mærkning af membranen. Tilføjelse overskydende farvestof fører til lysspredning AGGREGates på glas, som mindsker billedkvaliteten. Over-inkubere celler med farvestof fører til farvning internalisering, som har skadelige virkninger på billedkvalitet og muligvis celleviabilitet. Hvis en celle er plettet godt, vil der være klar sondring i P-og S-emission billeder. Som vist i figur 2A, vil P emission levende fremhæve områder af membranen, der er dækglas skrå (dvs. kanterne af cellen fodspor) mens S emissionsintensitet vil være nogenlunde ensartet over cellen fodaftryk. Hvis en klar sondring mellem P og S er ikke synlige, så er det muligt, at cellen dårligt er klæbet til underlaget eller cellemembranen er ikke sundt, og cellen ikke anvendes til forsøg. Vores tidligere undersøgelser beskriver pTIRFM udnyttet dil som fluorescerende membran probe. Her udnytter vi gjorde, fordi det er velegnet til dual-farve imaging eksperimenter, der beskæftiger GFP / pHluorin som den anden fluorofor. Vi ophidse gjorde with en 561 nm laser end 640 nm laser (som er tættere på excitation peak), fordi fluoroforen blegemidler hurtigere ved 640 nm. Trods det faktum, at 561 nm laser er på halen DID offentliggjorte ekscitationsspektret, fluorescens effektivt udsendes. En anden fordel ved 561 nm laser er, at det ophidser både dil og gjorde muligt for os at bruge den samme polarisering setup for begge sonder. Bemærk, at orienteringen af ​​fluoroforen i membranen vil påvirke fortolkning af membranen topologi. For eksempel, hvis en fluorofor var orienteret med sin overgang dipoler vinkelret på membranen plan (snarere end parallelt eller næsten parallelt, som det er tilfældet med dil eller gjorde), så plane membran regioner vil være lettere fremhævet af S i stedet for P emission. Vi har også beskrevet teknikker til isolering og elektroporation af bovine adrenal kromaffinceller. Den bovine chromaffin celle er en fremragende secretory model. Det har fordelene ved at være let at vedligeholde i kultur, der reagerer på en række af sekretoriske og besidder store sekretoriske vesikler, som er let visualiseres med konventionel lysmikroskopi. At udtrykke fluorescerende proteiner, celler elektroporeres i suspension før plating på kollagen-behandlede kultur retter. Det er vores erfaring, udtryk effektivitet er langt større med elektroporation end med enten Ca 2 +-fosfat eller Lipofectamine reagenser. Ulempen ved elektroporation er, at det kræver flere celler (så mange ikke overlever processen) og dyre kommercielle reagenser. Af årsager, der er uklart for os, ikke hver membran inkorporerer gjorde. Desuden er kun en brøkdel af cellerne på skålen transficeret. Finde celler, der er transficeret OG farves godt med DID kan være tidskrævende, hvorfor optimere betingelserne for farvning og elektroporation er indsatsen værd. Sammenfattende er dette enArtikel beskriver, hvordan pTIRFM gennemføres for at overvåge de hurtige og lokaliserede membran deformationer, der opstår under sammensmeltning af tætte kerne vesikler i bovine kromaffinceller. Selv om kun én ansøgning diskuteres, er teknikken velegnet til studiet af andre biologiske processer, der involverer ændringer i membran form, herunder endocytose, cytokinese og celle motilitet.

Den korrekte udførelse af exocytose kræver ekstreme ændringer i membrandobbeltlag form til præcist orkestreret. Forud for fusion, lokal bøjning af plasmamembranen under granulatet sker, delvis for at nedbringe den energi barriere for interaktion med dobbeltlag. Senere, da membraner fusionere, områder med høj krumning genereres og skal stabiliseres. Endelig skal sammensmeltede membraner bøjes ud af deres oprindelige form for at udvide fusion pore og muliggøre indhold release 1. Fordi membraner alene er usandsynligt at gennemgå sådanne dramatiske og koordinerede ændringer er nødvendige for at mægle begivenheder proteiner. Men hvordan de virker til at påvirke ændringer i membran topologi under fusionsprocessen er fortsat meget et åbent spørgsmål. Fremragende in vitro modeller eksisterer for at visualisere membran krumning. Brugen af ​​negativ-pletten EM, for eksempel, har været vigtigt for udformningen af ​​de nuværende molekylære modeller for handlinger foretaget af to p større handelroteins - synaptotagmin og dynamin (til anmeldelser, se Chapman 2 og Henshaw 3). De fleste real-time analyser af exocytose ikke registrerer krumning direkte. I stedet er krumning udledes analyser, der rapporterer om kinetikken for lumenal last release 4-8 eller ændringer i membranareal 9-11. PTIRFM bygger bro mellem in vivo og in vitro-undersøgelser ved at give direkte, real-time målinger af ændringer i membran micromorphology. PTIRFM, i en nonimaging tilstand, blev udviklet af Axelrod og kolleger til at måle orienteringen af NPD-PE inkorporeres i en model membran 12. Teknikken blev derefter anvendt til at visualisere dynamiske ændringer i levende celler mærket med dil og FM1-43 13-18. I pTIRFM er to flygtige felt polariseringer anvendes til sekventielt at excitere en membran-embedded probe: p-polarisation (i indfaldsplan) og s-polarisering (vinkelret på planet af forekomst). Forud for billeddannelse proben - i dette tilfælde gjorde - kortvarigt sættes til det ekstracellulære medium og får lov til at indskyde i plasmamembranerne i de celler, der skal undersøges. I områder, hvor membranen er parallel med den dækglas (som i en membran flæse eller indrykning), har vil også være ikke-parallelle. Derfor vil disse regioner være exciteres af p-pol stråle. Den p-pol stråle vil mindre effektivt ophidse gjorde i membran regioner, der er for det meste parallelle med dækglas. Pixel-til-pixel forholdet billeder (P / S) rapportering om udledning fra sekventiel p-og s-pol excitation af DID vil derfor specifikt fremhæve områder af membran deformation. I teorien P / S forhold billeder er følsomme over for selv små vinkler af plasmamembranen afvigelse fra dækglas med amplituden af de ændringer, som forudsiges af computersimuleringer 18. P / S billeder er også uafhængig af fluorofor afstand fra dækglas overflade og lokal fluorophorkoncentration. Lokal fluoroforen koncentration i stedet leveres af billeder rapportering om pixel-til-pixel summen af P-emission og 2 gange S emission (P +2 S). P +2 S målingen er følsom over for den præcise geometri indrykning, med nogle, lille eller ingen ændring muligt. Dette kan vises ved computersimuleringer som model overgange i en fusion pore fra en tidlig (dvs. med en smal hals) til en senere tilstand 16,18. P 2 S for et fusioneret vesikel knyttet til plasmamembranen via en smal hals (og med mere gjorde tæt på grænsefladen) forudsiges at være større for eksempel end en fusioneret vesikel med en meget bredere pore (hvor gjorde, er inden for den svageste del af flygtige felt). I denne artikel vil vi diskutere, hvordan pTIRFM implementeres og udnyttes til at studere de hurtige, lokaliserede ændringer i membran facon, der opstår under fusion pore dilatation. Mens kun én ansøgning er udtrykkeligt discussed er fremgangsmåderne generaliseres til en række andre celle biologiske processer, der direkte eller indirekte involverer membran remodeling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:277px;">iXon3 EMMCD Camera</td>
			<td style="width:179px;">Andor</td>
			<td style="width:147px;">897</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Side-mounted Filtercube Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">43 Series Ar-Ion Laser</td>
			<td>CVI Milles Griot Laser Optics</td>
			<td>543-AP-A01</td>
			<td>Tunable to 488nm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sapphire 561 LP Diode Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>561nm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scanning Galvo Mirror System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">VC3 Channel Focal Perfusion System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA VC3X4PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">QMM Quartz MicroManifold</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA QMM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10 PSI Pressure Regulator</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA PR10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Manipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>TS 5000-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Six Station Neutral Density Wheel</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Stepper-motor Driven SmartShutter</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>IQ25-1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HQ412lp Dichroic Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC255583</td>
			<td>Joins 488nm and 561nm beams</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Concave Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 100mm VIS 0</td>
			<td>Diverges 488nm beam</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Concave Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 250mm VIS 0</td>
			<td>Diverges 561nm beam</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Convex Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 125mm VIS 0</td>
			<td>Focuses both beams</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Convex Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 50mm VIS 0</td>
			<td>Cemented to filter cube assembly</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">z488/561rpc Dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>z488/561rpc</td>
			<td>Filtercube dichroic</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">z488/561_TIRF Emission Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>z488/561m_TIRF</td>
			<td>Filtercube emission</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">UIS2 60x Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 60XO</td>
			<td>NA 1.37</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MetaMorph Imaging Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DiI Membrane Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>For Alignment Purposes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TH Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401135001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TL Liberse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DNAse I Type IV from bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DiD Membrane Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">.22 &#956;m Membrane Syringe Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507</td>
			<td>0.5 microns</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Immersion Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Controlls galvo mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1965-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging plasma membrane deformations with ptirfm

For at få nye indsigter i dynamikken i exocytose, vores gruppe har fokus på ændringerne i lipiddobbeltlaget form, der skal præcist reguleres under sammensmeltning af vesikel og plasma membraner. Disse hurtige og lokale ændringer opnås ved dynamiske interaktioner mellem lipider og specialiserede proteiner, der styrer membran krumning. Fraværet af sådanne interaktioner ikke blot ville få ødelæggende konsekvenser for vesikelfusion, men et væld af andre cellulære funktioner, der involverer kontrol af membran form. I de senere år har identiteten af ​​en række proteiner med membran-forme egenskaber blevet bestemt. Hvad er der mangler, er en køreplan for, hvornår, hvor og hvordan de fungerer som fusion og indhold release fremskridt. Vores forståelse af de molekylære begivenheder, der sætter membran remodeling har historisk set været begrænset af mangel på analysemetoder, der er følsomme over for membran krumning eller har den tidsmæssige opløsning til Track hurtige ændringer. PTIRFM opfylder begge disse kriterier. Vi diskuterer, hvordan pTIRFM er implementeret for at visualisere og fortolke hurtige, submicron ændringer i retningen af ​​chromaffin cellemembraner i tæt kerne vesikel (DCV) fusion. De kromaffinceller vi bruger er isoleret fra kvæg binyrerne. Membranen er farves med en lipofil carbocyanine farvestof, 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorbenzensulfonat, eller gjorde. DiD intercalates i membranen plan med en &quot;fast&quot; orientering og er derfor følsom over for polarisationen af ​​flygtige felt. DID-farvede cellemembranen er sekventielt begejstret med retvinklede polariseringer af en 561 nm laser (p-pol, s-pol). En 488 nm laser bruges til at visualisere vesikel bestanddele og tidspunkt tidspunktet for fusion. Eksocytose udløst af lokalt perfusion celler med et depolariserende KCl-opløsning. Analyse udføres offline med custom-skrevet software til at forstå, hvordan gjordeemissionsintensiteten ændringer vedrører fusion pore dilatation.

Konventionelle og polariserede TIRFM billeddannende teknikker er implementeret på den samme luft bord. Konfigurationen af de optiske elementer er ens, med den væsentlige forskel, at excitationslyset er polariseret (figur 1A). Polariseret lys fortrinsvis ophidser fluorophores med absorption dipoler i polarisering retning. Således pTIRFM at være effektiv til overvågning membran topologiske ændringer skal sonden, der bruges interkalere i membranen med en fast orientering. De fluorescerende carbocyanine farvestoffer (DII, gjorde) interkalere i lipid dobbeltlag i en orienteret måde med overgangseffekter dipoler i membranen plan (figur 1B). P-polariseret belysning (figur 1C) af DID-mærkede membraner selektivt ophidser dækglas-skrå fluorophores (RED i figur 1B og 1D). Membran mærkning af kromaffinceller overstrømmende opnås efter ABrief inkubation med gjorde. Figur 2A viser et eksempel på en cellemembran, der farves godt. En sund, vedhængende celle vil udstille tydelige forskelle i P og S-emissioner. P emission billedet viser en lysere cellekanten med hensyn til resten af ​​cellen. S emission billedet viser nogenlunde ensartede fluorescens over cellen fodaftryk. Beregnet pixel-til-pixel P / S og P +2 S billeder er følsomme over for membran krumning og farvestof koncentration, hhv. Den chromaffinceller celle vist er også blevet transficeret med synaptotagmin 1 pHluorin (Syt-1) til at mærke sekretoriske vesikler (Figur 2B). Den chromaffinceller celle stimuleret med 56 mM KCI for at depolarisere cellemembranen og udløse eksocytose. En række lyst fluorescerende Syt-1 pHluorin spots pludselig bliver tydelig, idet DCVs sikring (figur 2B, højre panel). En hvid boks er trukket omkring en fusion begivenhed (figur 2B, højre panel). Denne fusion begivenhed is analyseret i figur 2C og 2D. Figur 2C viser frame-by-frame ændringer i Syt-1-pHluorin, P / S og P +2 S billeddata intensiteter. Fluorescensintensitet Syt-1 hurtigt mindskes som proteinet diffunderer væk fra fusion (figur 2D). Indrykningen repræsenterer smeltet vesikel / plasma membran kompleks mindskes ved en relativt langsommere (Bemærk grafer i figur 2D). Illustrationen (Figur 2E) viser en fortolkning af disse målinger. De hurtige og lokaliserede membran deformationer vist i figur 2 er et resultat af stimulus-fremkaldte Ca2 + tilstrømning. Dette er vist i figur 3A. En chromaffin celle transfekteres med den genetiske Ca 2 + indikator GCaMP5G 21,22 og stimuleret med 56 mM KCl. Membrandepolarisering forårsager en betydelig stigning i GCaMP5G fluorescens ( <stro<html> ng&gt; Figurerne 3A og 3B) der udtrykker en stigning i subplasmalemmal Ca2 +-niveauer. En 30 x 20 pixel region af cellen er valgt, og frame-by-frame ændringer i GCaMP5G, P / S og P +2 S pixel intensiteter er vist i billederne (figur 3b) og grafer (figur 3C). Time &quot;0&quot; betegner rammen, før en ændring af en P / S er klart (dvs. rammen, før exocytose). De hvide pilespidser indikerer, at membranen deformation (stigning i P / S) er ledsaget af et fald i P +2 S emission. Den cytosol GCaMP5G protein er udelukket fra området ved smeltet DCV. Bemærk også den pludselige nedgang i GCaMP5G intensitet ved tiden 0 i figur 3C, venstre panel. Det langlivede stigning i P / S og et fald i P +2 S foreslå en fusion pore, der udvider langsomt (figur 3D). / Files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Illustrationer til pTIRFM teknik. A) En skematisk for at kombinere traditionel med polarisering-baserede TIRF billeddannelse vises. En fjerdedel-wave (QW) plade er placeret foran en 561-nm safir laser til elliptisk polarisere laserstrålen. En polariserende cube (PC1) anvendes til at adskille polariseringer i lineære lodrette (V) og horisontal (h) komponenter. De lodrette og vandrette komponenter bliver p-pol og S-pol excitation bjælker henholdsvis i TIR-overflade. De p-pol-og s-pol stier uafhængigt nøglehullet (S1 og S2). De er rekombineret med spejle og en anden polariserende cube (PC2). De slutte sig til 488 nm stråle (også uafhængigt tilskoddede, S3) via en stråle styretøj element, der består af et spejl og nonpolarizing dichroic spejl (DC). Linser (L) bruges til at udvide og fokusere strålerne. Kombineret 488-nm og 561 nm bjælker er styrende til en side belysning port af mikroskopet via galvanometer spejle (GM). De fokuserer på bagsiden brændplanet (BFP) af målet. Fotoner udsendt fra fluorophorer er fanget på en EMCCD kamera tilsluttet en PC. B) har mærkningen udføres ved kortvarigt at inkubere cellerne med farvestoffet og vask gentagne gange for at fjerne overskydende. DiD intercalates i membranen med sin overgang dipolmomenter groft i membranen flyet. C) Den indfaldende lys polariseret i indfaldsplan (p-pol) skaber et rumligt dæmpede felt, der overvejende er polariseret vinkelret på grænsefladen, som vist. D) Belysning af en DID-mærket membran med p-polariseret lys vil selektivt ophidse de fluorophores der er dækglas-skrå (RED). Hvis dette var en s-polariseret flygtige felt, ville disse fluorophorer, der er parallelt med dækglas exciteres stedet (sort). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51334/51334fig2.jpg" /> Figur 2. </s<html> Trong&gt; Overvågning cellemembranen deformationer med pTIRFM. A) Raw P og S emission billeder sammen med beregnede P / S og P +2 S emission billeder skal vises. Scale bar, 3,2 mM. B) En chromaffin celle udtrykker Syt-1 pHluorin er depolariseret med KCl. En række lyst fluorescerende pletter (højre panel) angiver fusion af individuelle DCVs. Scale bar, 3,2 mM. C) frame-by-frame billeder af en sammensmeltning Syt-1 pHluorin DCV. Times (billederne ovenfor), er i sekunder. Tid 0 betegner ramme før fusion af DCV. Svarende P / S og P +2 emission billeder S er også vist. . Målestokken er 1 um D) Grafer for billeder i C. Den stiplede linje er på tid 0 -. Fusion stel E) En mulig tolkning af resultaterne i C og D er vist.<html> blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51334/51334fig3.jpg" /> Figur 3. Deformationer er et resultat af stimulus-fremkaldte Ca2 + indstrømning. A) En chromaffin celle transficeret med GCaMP5G er depolariseret med 56 mM KCl. Den deraf følgende stigning i GCaMP5G fluorescens angiver en stigning i subplasmalemmal Ca 2 + niveauer. B) frame-by-frame billeder af 30 x 20 pixel område celle i A. Times billederne ovenfor er i sekunder. Hvide pilespidser indikerer en region af P / S stigning og P +2 S fald. Cytosole GCaMP5G protein er udelukket fra regionen ved fusing DCV. Målestokken, 1 mM. C) Grafer for illustrationerne i B. D) En mulig fortolkning af resultaterne i B og C er vist.3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> iXon3 EMMCD Camera </td><td> Andor </td><td> 897 </td><td></td></tr><tr><td> IX81 omvendt mikroskop </td><td> Olympus </td><td></td><td> Sidemonteret Filtercube Assembly </td></tr><tr><td> 43 Series Ar-Ion Laser </td><td> CVI Milles Griot Laser Optik </td><td> 543-AP-A01 </td><td> Tunable til 488 nm </td></tr><tr><td> Sapphire 561 LP Diode Laser </td><td> Sammenhængende </td><td></td><td> 561 nm </td></tr><tr><td> Scanning Galvo Mirror System </td><td> Thorlabs </td><td> GVS102 </td><td></td></tr><tr><td> VC 3 Channel Focal perfusionssystem </td><td> ALA Scientific Instruments </td><td> ALA VC3X4PP </td><td></td></tr><tr><td> QMM Quartz MicroManifold </td><td> ALA Scientific Instruments </td><td> ALA QMM-4 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> 10 psi Pressure Regulator </td><td> ALA Scientific Instruments </td><td> ALA PR10 </td><td></td></tr><tr><td> Manipulator </td><td> Burleigh </td><td> TS 5000-150 </td><td></td></tr><tr><td> Monteret Achromatic kvartbølgeplade </td><td> Thorlabs </td><td> AQWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> 420-680 nm polarisationsfilter stråleopdeleren Cube </td><td> Thorlabs </td><td> PBS201 </td><td></td></tr><tr><td> Seks Station Neutral Density Wheel </td><td> Thorlabs </td><td> FW1AND </td><td></td></tr><tr><td> Stepper-motor Driven SmartShutter </td><td> Sutter Instrumenter </td><td> IQ25-1219 </td><td></td></tr><tr><td> HQ412lp Dichroic Filter </td><td> Chroma </td><td> NC255583 </td><td> Sammenføjninger 488 nm og 561 nm bjælker </td></tr><tr><td> Coated plankonkav Lens </td><td> Edmund Optics </td><td> PCV 100mm VIS 0 </td><td> Divergerer 488 nm stråle </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Coated plankonkav Lens </td><td> Edmund Optics </td><td> PCV 250mm VIS 0 </td><td> Divergerer 561 nm stråle </td></tr><tr><td> Coated Plano-konveks linse </td><td> Edmund Optics </td><td> PCX 125mm VIS 0 </td><td> Fokuserer begge bjælker </td></tr><tr><td> Coated Plano-konveks linse </td><td> Edmund Optics </td><td> PCX 50mm VIS 0 </td><td> Cementeret til at filtrere terning samling </td></tr><tr><td> z488/561rpc Dichroic </td><td> Chroma </td><td> z488/561rpc </td><td> Filtercube dichroic </td></tr><tr><td> z488/561_TIRF Emission Filter </td><td> Chroma </td><td> z488/561m_TIRF </td><td> Filtercube emission </td></tr><tr><td> UIS2 60X Formål </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 60XO </td><td> NA 1,37 </td></tr><tr><td> Neon transfektionssystemet </td><td> Invitrogen </td><td> MPK 5000 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph billedbehandlingssoftware </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Dil Membrane Dye </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Til opretning Formål </td></tr><tr><td> TH Liberase </td><td> Roche </td><td> 5401135001 </td><td></td></tr><tr><td> TL Liberse </td><td> Roche </td><td> 5401020001 </td><td></td></tr><tr><td> DNAse I type IV fra kvæg </td><td> Sigma </td><td> D5025 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Fisher </td><td> 0267110 </td><td></td></tr><tr><td> DiD Membrane Dye </td><td> Invitrogen </td><td> D-7757 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamin </td><td> Invitrogen </td><td> R634 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Syringe Filter Unit </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Polykromatiske Red mikrosfærer </td><td> Polysciences </td><td> 19507 </td><td> 0,5 um </td></tr><tr><td> Immersion Oil </td&gt; <td> Sigma </td><td> 56822 </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td></td><td> Controls galvo spejle </td></tr><tr><td> Spinnerkolben </td><td> Bellco </td><td> 1965-00.250 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. pTIRF Microscopy udstyr. <table><tbody><tr><td> Indhold </td><td> Prep-PSS </td><td> Basal-PSS </td><td> Stim-PSS </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 145 mM </td><td> 145 mM </td><td> 95 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5.6 mM </td><td> 5.6 mM </td><td> 56 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> - </td><td> 2.2 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 15 mM </td><td> 15 mM </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td><td> 7.4 </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td> Glukose </td><td> 2,8 mm </td><td> 5.6 mM </td><td> 5.6 mM </td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> 1x </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Perfusion og chromaffinceller celle prep løsninger. <table><tbody><tr><td> Indhold </td><td> Elektroporere Media </td><td> Normal Belægning Media </td><td> 2x antibiotisk Media </td></tr><tr><td> 1x DMEM/F-12 </td><td> 1 ml / plade </td><td> 2 ml / plade </td><td> 1 ml / plade </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> 10% </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Cytosin arabinofuranosid (CAF) </td><td> - </td><td> 1 ul / ml fra 10 mM Stock </td><td> - </td></tr><tr><td> Penicillin </td><td> - </td><td> 100 enheder / ml </td&gt; <td> 200 enheder / ml </td></tr><tr><td> Streptomycin </td><td> - </td><td> 100 ug / ml </td><td> 200 ug / ml </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> - </td><td> 25 ug / ml </td><td> 50 ug / ml </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Chromaffinceller Cell medier. <table><tbody><tr><td> Indhold </td><td> TH-PSS </td><td> TL-PSS </td></tr><tr><td> Liberase TH </td><td> 2 ml </td><td> - </td></tr><tr><td> Liberase TL </td><td> - </td><td> 0,85 ml </td></tr><tr><td> Prep-PSS </td><td> 98.0 ml </td><td> 84,0 ml </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 8,75 mg </td><td> 7.4 mg </td></tr></tbody></table> Tabel 4. TH-PSS og TL-PSS løsninger.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM at JoVE.com

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Polarisering-baserede total intern refleksion fluorescensmikroskopi (pTIRFM) muliggør real-time detektering af cellemembran dynamik. Denne artikel beskriver implementeringen af ​​pTIRFM for studiet af membranen remodellering under reguleret exocytose. Teknikken er generaliseres til andre processer i cellebiologi, der direkte eller indirekte involverer ændringer i membran form.

Imaging plasmamembranen Deformations Med pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Kortlægning af molekylær diffusion i plasmamembranen ved Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Real-time Analyser af Retinol Transport af membranen Receptor af Plasma retinolbindingsprotein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtilstand udtynding super-resolution Imaging i pattedyrceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Bestemmelse af Plasma membran partitionering for perifert forbundet proteiner

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Karakterisering af MLKL-medieret plasmamembran brud i Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

Isolere og Imaging Live, Intakt Pacemaker Regioner af Mouse Renal Bækken ved Vibratome Sektion

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...