Name: imaging plasma membrane deformations with ptirfm
Uploaded: 2014-04-02T16:30:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM at JoVE.com

Это исследование опирается на национальный Грант Ученый развития (13SDG14420049) до АА от Американской ассоциации сердца и пуско-наладочных средств из Wayne State University. Мы в долгу перед доктором Рональда Holz и д-р Мэри Биттнер за предоставление консультаций по вопросам рогатого надпочечников препаратов и д-р Даниэль Аксельрода о помощи с pTIRFM настройке и полезные замечания по рукописи. Syt-1 pHluorin был использован с разрешение доктора Геро Miesenbock (Оксфордский университет). GCAMP5G был получен через Addgene. Мы благодарим Джеймса Т. Тейлор, Tejeshwar Рао, Рэйчел Л. Aikman и Praneeth Katrapti с помощью на оптимизации различных этапов процедур, описанных.

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Membranes of the world unite! Cell Biol. 175, 201-207 (2006).</li><li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+synaptotagmin+trigger+neurotransmitter+release.">How does synaptotagmin trigger neurotransmitter release.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 615-641 (2008).</li><li>Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+and+its+role+in+membrane+fission.">Dynamin and its role in membrane fission.</a> Annu. Cell Dev. Biol. 16, 483-519 (2000).</li><li>Lang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-triggered+peptide+secretion+in+single+cells+imaged+with+green+fluorescent+protein+and+evanescent-wave+microscopy.">Ca2+-triggered peptide secretion in single cells imaged with green fluorescent protein and evanescent-wave microscopy.</a> Neuron. 18 (6), 857-863 (1997).</li><li>Steyer, J. A., Horstman, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells.">Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> Nature. 388, 474-478 (1997).</li><li>Allersma, M. W., Wang, L., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+regulated+exocytosis+with+a+granule-membrane+probe+using+total+internal+reflection+microscopy.">Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 4658-4668 (2004).</li><li>Toomre, D., Steyer, J. A., Keller, P., Almers, W., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+constitutive+membrane+traffic+with+the+cell+surface+observed+by+evanescent+wave+microscopy.">Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy.</a> J. Cell Biol. 149, 33-40 (2000).</li><li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li><li>Heinemann, C., Chow, R. H., Neher, E., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+secretory+response+in+bovine+chromaffin+cells+following+flash+photolysis+of+caged+Ca2.">Kinetics of the secretory response in bovine chromaffin cells following flash photolysis of caged Ca2.</a> Biophys. J. 67, 2546-2557 (1994).</li><li>Heidelberger, R., Heinemann, C., Neher, E., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dependence+of+the+rate+of+exocytosis+in+a+synaptic+terminal.">Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal.</a> Nature. 371 (6497), 513-515 (1994).</li><li>Chow, R. H., Klingauf, J., Heinemann, C., Zucker, R. S., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+determining+the+time+course+of+secretion+in+neuroendocrine+cells.">Mechanisms determining the time course of secretion in neuroendocrine cells.</a> Neuron. 16, 369-376 (1996).</li><li>Thompson, N. L., McConnell, H. M., Burhardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+in+supported+phospholipid+monolayers+detected+by+the+dichroism+of+fluorescence+excited+with+polarized+evanescent+illumination.">Order in supported phospholipid monolayers detected by the dichroism of fluorescence excited with polarized evanescent illumination.</a> Biophys. J. 46, 739-747 (1984).</li><li>Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+orientation+visualized+by+polarized+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence.</a> Biophys. J. 77, 2266-2283 (1999).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Feldman, M. E., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane+marker+leaves+synaptic+vesicles+in+milliseconds+after+exocytosis+in+retinal+bipolar+cells.">A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells.</a> Neuron. 35, 1085-1097 (2002).</li><li>Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+plasma+membrane+deformations+reveals+pre-fusion+membrane+curvature+changes+and+a+role+for+dynamin+in+the+regulation+of+fusion+pore+expansion.">Real-time imaging of plasma membrane deformations reveals pre-fusion membrane curvature changes and a role for dynamin in the regulation of fusion pore expansion.</a> J. Neurochem. , 10-1111 (2012).</li><li>Anantharam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+role+for+the+dynamin+GTPase+in+the+regulation+of+fusion+pore+expansion.">A new role for the dynamin GTPase in the regulation of fusion pore expansion.</a> Mol. Biol. Cell. 22, 1907-1918 (2011).</li><li>Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+TIRFM+reveals+changes+in+plasma+membrane+topology+before+and+during+granule+fusion.">Polarized TIRFM reveals changes in plasma membrane topology before and during granule fusion.</a> Cell Mol. Neurobiol. 30, 1343-1349 (2010).</li><li>Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+topological+changes+of+the+plasma+membrane+upon+exocytosis+visualized+by+polarized+TIRFM.">Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM.</a> J. Cell. 188, 415-428 (2010).</li><li>Wick, P. W., Senter, R. A., Parsels, L. A., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+studies+of+secretion+in+bovine+chromaffin+cells+and+PC12+cells:+generation+of+kainate-sensitive+chromaffin+cells.">Transient transfection studies of secretion in bovine chromaffin cells and PC12 cells: generation of kainate-sensitive chromaffin cells.</a> J. Biol. Chem. 268, 10983-10989 (1993).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1248-1253 (2007).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li></ol>

Авторы не имеют никакого отношения к раскрывать.

Поляризация основе TIRFM обнаруживает быстрые, субмикроскопические изменения мембранного топологии. Реализация метода является относительно простым, особенно если TIRF оптика уже на месте. Все, что необходимо, так это четвертьволновой пластинки, два поляризационный куб, и жалюзи, чтобы отделить р-Pol и с-пол освещения пути. Точное положение этих компонентов на столе обычно диктуется пространства. Для того чтобы получить мембраны топологической информации, флуоресцентный зонд использовали должны интеркаляции с фиксированным или известной ориентации. Методика, как описано в этой статье, предполагает использование карбоцианиновых красителей, но и другие красители, такие как FM1-43, 14 также могут быть использованы. Сама процедура окрашивания мембраны проста. Искусственный клетки требуют лишь небольшого экспозиции (менее 10 сек) в небольшом количестве Dii / DID для получения буйный маркировки мембраны. Добавление избыток красителя приводит к легкой Aggreg рассеянияАтеш на стекле, которые умаляют качество изображения. Более-инкубации клеток с красителем приводит красить интернационализации, которая оказывает негативное воздействие на качество изображения и, возможно, жизнеспособности клеток. Если ячейка окрашивается хорошо, будет четкое различие в образах выбросов P и S. Как показано на фиг.2А, излучение P будет ярко выделить области мембраны, которые покровное косой (т.е. краев клеток след), а интенсивность излучения S будет примерно одинаковым по клеточной след. Если четкое различие между Р и S не являются очевидными, то вполне возможно, что клетка слабо привязаны к подложке или клеточная мембрана не здоров, и ячейка не используется для экспериментов. Наши предыдущие исследования, описывающие pTIRFM использованы Dii как флуоресцентного мембранного зонда. Здесь мы используем сделал, потому что он подходит для экспериментов с изображениями двухцветными, которые используют GFP / pHluorin как другой флуорофором. Мы возбуждают сделал шй 561 нм лазер, а не нм лазер 640 (который ближе к своему пику возбуждения), потому что флуорофорные отбеливатели быстрее при 640 нм. Несмотря на то, что нм лазер 561 находится на хвосте сделал Опубликовано спектр возбуждения, флуоресценция эффективно испускается. Еще одно преимущество нм лазер 561 является то, что она возбуждает обе Dii и сделал позволяет нам использовать те же установки поляризации для обоих зондов. Следует отметить, что ориентация флуорофора в мембране будет влиять на интерпретацию мембранной топологии. Например, если флуорофор были ориентированы своими переходных диполей перпендикулярно к плоскости мембраны (а не параллельно или почти параллельно, как в случае с DII или же), то неплоских областей мембраны будет более легко выделены с помощью S, а не P выбросов. Мы также описали методы для выделения и электропорации крупного рогатого надпочечников хромаффинных клеток. Бычьего хромаффинных клеток является отличным сecretory модель. Он имеет преимущества быть легко поддерживать в культуре, в ответ на различных secretogogues, и обладающие большими секреторных везикул, которые легко визуализируются с обычной световой микроскопии. Чтобы выразить флуоресцентные белки, клетки электропорации в суспензии до высева на коллагеновых обработанных чашек для культивирования. По нашему опыту, эффективность выражение намного выше с электропорации, чем с любой Ca 2 +-фосфата или Lipofectamine реагентов. Недостатком электропорации является то, что он требует больше клеток (как многие не выживают процесс) и дорогие коммерческие реагенты. По причинам, которые для нас неясным, не каждый мембрана включает сделал. Кроме того, только часть из клеток на блюдо трансфецируют. Поиск клетки, которые трансфицированными И окрашиваются хорошо с DID может занять много времени, поэтому оптимизация условий для окрашивания и электропорации хорошо стоит затраченных усилий. Таким образом, этотСтатья описывает, как pTIRFM реализуется следить за быстрые и локализованные мембранных деформаций, возникающих при синтезе плотных основных пузырьков в бычьих хромаффинных клеток. Хотя только одно приложение обсуждается, метод идеально подходит для изучения других биологических процессов, которые включают изменения в форме мембраны, в том числе эндоцитоза, цитокинеза и подвижности клеток.

Надлежащее исполнение экзоцитоза требуется экстремальные изменения мембранного бислоя форме, чтобы быть точно организовал. До синтеза, местный изгиб плазматической мембраны под гранул происходит, в частности, чтобы уменьшить энергетический барьер для взаимодействия бислоев. Позже, когда слияние мембраны, области высокой кривизны генерируются и должна быть стабилизирована. Наконец, слитые мембраны должны быть согнуты из их первоначальной форме, чтобы расширить поры слияния и позволяют контента освобождение 1. Потому что одни мембраны вряд ли претерпит такие драматические и скоординированных изменений, белки необходимы в качестве посредника события. Но как они действуют влиять изменения мембранного топологии в процессе слияния остается очень открытым. Отлично в пробирке моделей существуют визуализировать мембраны кривизну. Использование отрицательной пятна EM, например, имело важное значение для формирования текущих молекулярные модели за действия двух основных торговли рroteins - синаптотагмин и динамин (см. обзоры Чепмен 2 и Хеншо 3). Большинство в режиме реального времени анализы экзоцитоза не обнаружить кривизну напрямую. Вместо этого, кривизна выводится из анализов, которые сообщают о кинетике просвета грузов выпуска 4-8 или изменения в площадь мембраны 9-11. PTIRFM устраняет разрыв между в естественных условиях и в пробирке исследования, позволяя прямые, в режиме реального времени измерения изменений в мембранной микроморфологии. PTIRFM, в режиме nonimaging, был впервые Аксельрода и коллегами для измерения ориентации NPD-PE включены в модельной мембраны 12. Техника была затем применяется для визуализации динамические изменения в живых клетках, меченных Dii и FM1-43 13-18. В pTIRFM, два мимолетных поляризации поля используются для последовательно возбуждают мембранный встраиваемый зонд: р-поляризации (в плоскости падения) и S-поляризации (перпендикулярно плоскости падения). До обработки изображений, зонд - в этом случае сделали - кратко добавлен в внеклеточной среде и допускается к интеркаляции в плазматических мембранах клеток для изучения. В регионах, где мембрана непараллельны к покровного стекла (как в мембранный суеты и отступы), сделал также будет непараллельны. Поэтому такие регионы будет возбудимы по р-Pol луча. Р-пол пучка будет менее эффективно возбуждают сделал в мембранных регионах, которые в основном параллельны покровного стекла. Соотношение пиксель-в-пиксель изображения (P / S) отчетности по эмиссии из последовательного р-и S-POL возбуждения сделал будет поэтому специально выделить регионы деформации мембраны. В теории, соотношение изображения P / S чувствительны даже к небольшим углом плазмы отклонения мембраны от покровного стекла, с амплитудой изменения прогнозируемых с помощью компьютерного моделирования 18. P / S изображения также не зависят от флуорофора расстоянии от поверхности покровного стекла и местный флуорофоромконцентрация. Концентрация Часовой флуорофор вместо обеспечивается изображений отчетности по сумме пиксель в пиксель излучения P и 2 раза S излучения (P +2 S). P +2 измерения S чувствительна к точной геометрии отпечатка, с некоторыми, мало, или совсем не изменились возможного. Это можно показать с помощью компьютерного моделирования, что модель переходы поры слияния с раннего (т.е. с узким горлышком) на более поздний государства 16,18. P 2 S из плавленого пузырька, прикрепленной к плазматической мембране через узким горлышком (и с более сделал близко к границе раздела) по прогнозам, будет больше, например, чем у плавленого пузырька с гораздо более широкой поры (где сделал это в темному части затухающих области). В этой статье мы рассмотрим, как pTIRFM реализуется и используется для изучения быстрых, локализованные изменения в форме мембраны, которые происходят во время слияния пор расширения. В то время как только одна заявка явно диscussed, эти методы распространены на различных других биологических процессов клеток, которые прямо или косвенно создают мембраны ремоделирования.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:277px;">iXon3 EMMCD Camera</td>
			<td style="width:179px;">Andor</td>
			<td style="width:147px;">897</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Side-mounted Filtercube Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">43 Series Ar-Ion Laser</td>
			<td>CVI Milles Griot Laser Optics</td>
			<td>543-AP-A01</td>
			<td>Tunable to 488nm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sapphire 561 LP Diode Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>561nm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scanning Galvo Mirror System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">VC3 Channel Focal Perfusion System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA VC3X4PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">QMM Quartz MicroManifold</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA QMM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10 PSI Pressure Regulator</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA PR10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Manipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>TS 5000-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Six Station Neutral Density Wheel</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Stepper-motor Driven SmartShutter</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>IQ25-1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HQ412lp Dichroic Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC255583</td>
			<td>Joins 488nm and 561nm beams</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Concave Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 100mm VIS 0</td>
			<td>Diverges 488nm beam</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Concave Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 250mm VIS 0</td>
			<td>Diverges 561nm beam</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Convex Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 125mm VIS 0</td>
			<td>Focuses both beams</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Convex Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 50mm VIS 0</td>
			<td>Cemented to filter cube assembly</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">z488/561rpc Dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>z488/561rpc</td>
			<td>Filtercube dichroic</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">z488/561_TIRF Emission Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>z488/561m_TIRF</td>
			<td>Filtercube emission</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">UIS2 60x Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 60XO</td>
			<td>NA 1.37</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MetaMorph Imaging Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DiI Membrane Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>For Alignment Purposes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TH Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401135001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TL Liberse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DNAse I Type IV from bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DiD Membrane Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">.22 &#956;m Membrane Syringe Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507</td>
			<td>0.5 microns</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Immersion Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Controlls galvo mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1965-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging plasma membrane deformations with ptirfm

Чтобы получить новые проливает свет на динамику экзоцитоза, наша группа основное внимание уделяется изменениям в липидном форме двухслойной, которые должны быть точно регулируемых во время слияния везикул и плазматических мембран. Эти быстрые и локализованные изменения достигаются динамического взаимодействия между липидов и специализированных белков, которые контролируют мембраны кривизну. Отсутствие таких взаимодействий не только иметь разрушительные последствия для слияния пузырьков, но целый ряд других клеточных функций, которые включают контроль формы мембраны. В последние годы, идентичность ряда белков с мембранами формировании свойств была определена. То, что остается хватает, так это дорожная карта, когда, где и как они действуют как слияния и прогресса выпуска содержимого. Наше понимание молекулярных событий, которые позволяют мембраны ремоделирования исторически были ограничены отсутствием аналитических методов, которые чувствительны к мембранной кривизны или имеют временное разрешение на TracК быстрые изменения. PTIRFM удовлетворяет обоим этим критериям. Мы обсудим, как pTIRFM реализуется визуализировать и интерпретировать быстрые, изменения субмикронных в ориентации хромаффинных клеточных мембран во время плотного ядра пузырька (DCV) синтеза. Хромаффинных клетки, которые мы используем изолированы от крупного рогатого надпочечников. Мембрана окрашивали с липофильным карбоцианиновым красителем, 1,1 &#39;-диоктадецил-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-хлорбензолсульфонат, или сделал. DiD интеркалирует в плоскости мембраны с &quot;фиксированной&quot; ориентации и поэтому чувствительны к поляризации затухающих области. Сделал окрашенных клеточная мембрана последовательно волнует ортогональных поляризаций 561 нм лазера (р-пол, с-Pol). 488 нм лазер используется для визуализации везикул составляющие и время момент слияния. Экзоцитоз запускается локально перфузии клеток с деполяризующего раствора KCl. Анализ проводится форума с помощью пользовательского написанный программного обеспечения, чтобы понять, как сделализменения интенсивности излучения относятся к термоядерной пор расширения.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM at JoVE.com

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Поляризация на основе полном внутреннем отражении флуоресцентной микроскопии (pTIRFM) позволяет обнаруживать в реальном времени динамики клеточных мембран. Эта статья описывает реализацию pTIRFM для изучения мембранной ремоделирования во время регулируемого экзоцитоза. Методика распространены на другие процессы в клеточной биологии, которые прямо или косвенно связаны с изменениями в форме мембраны.

Изображений с плазменным Мембрана Деформации С pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Измерение Ближнего плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в астроциты

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Измерение плазматической мембраны Белки Endocytic Цены на Реверсивные биотинилирование

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Отображение молекулярной диффузии в плазме мембраны Несколько-Target трассировки (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

В режиме реального времени Анализы транспорта ретинола на мембранный рецептор плазменных Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Основного состояния истощения суперразрешением изображений в клетках млекопитающих

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Определение плазматической мембраны секционирования для периферически связанных белков

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Характеристика MLKL-опосредованной плазматической мембраны разрыв в Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

Изоляция и визуализация живых, интактных кардиостимуляторных областей почечной лоханки мыши путем вибратомного сечения

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...