Name: consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting
Uploaded: 2014-04-10T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting at JoVE.c

Diese Arbeit wurde von INSERM, Universität Lille 2 unterstützt, MEDIALZ, LABEX (Exzellenz Labor-Programm zu investieren für die Zukunft) und DISTALZ (Entwicklung innovativer Strategien für eine transdisziplinäre Ansatz zur Alzheimer-Krankheit). FJ.FG ist derzeit ein Empfänger Gemeinschaft von ANR (Französisch National Research Agency / NeuroSplice de Projet Tau ANR-2010-BLAN-1114 01), aber diese Arbeit im Rahmen der Unterstützung von einem Stipendium der JCCM (Spanien) war.

1. Homogenisierung und Gesamtproteinextraktion aus Mensch und Maus Gehirngewebe <ol><li> Hirngewebe Homogenisierung. Homogenisieren des Gehirngewebes 10% (w / v) in 8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff und 1% w / v SDS-Puffer (UTS) mit einem Potter-Glas (für menschliche Proben) oder Teflon-Homogenisator (für Mäuse Proben). Ultraschallbad bei 60 Hz 30 Impulse mit einer Ultraschallgenerator, indem 0,5 sec für die Gesamt Gewebe Zerfall 13, 14. <ol><li> Bestimmen Proteinkonzentration mit Bradford-Test, mit BSA ...

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	<li>Collins, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grand+challenges+in+global+mental+health.">Grand challenges in global mental health.</a> Nature. 475, 27-30 (2011).</li><li>De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Bu&#233;e, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , 449-468 (2011).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-covalent+and+covalent+protein+labeling+in+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis.</a> J Proteomics. 71, 231-244 (2008).</li><li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+DIGE+system:+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology.">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).</li><li>Westermeier, R., Scheibe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+gel+electrophoresis+based+on+lys/cys+tagging.">Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging.</a> Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).</li><li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ventral+furrow+morphogenesis:+a+proteomic+analysis.">Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis.</a> Development. 131, 643-656 (2004).</li><li>Gharbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+for+proteomic+expression+analysis+of+a+model+breast+cancer+cell+system.">Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+pathology+modulates+Pin1+post-translational+modifications+and+may+be+relevant+as+biomarker.">Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker.</a> Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).</li><li>Bretteville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+electrophoresis+of+tau+mutants+reveals+specific+phosphorylation+pattern+likely+linked+to+early+tau+conformational+changes.">Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes.</a> PLoS One. 4, 4843 (2009).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+characterization+of+paired+helical+filament-tau+from+Alzheimer's+disease:+demonstration+of+an+additional+74-kDa+component+and+age-related+biochemical+modifications.">Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications.</a> J Neurochem. 69, 834-844 (1997).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+distribution+of+phosphorylated+tau+protein+isoforms+in+Alzheimer's+and+Pick's+diseases.">Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases.</a> FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).</li><li>Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergents+and+chaotropes+for+protein+solubilization+before+two-dimensional+electrophoresis.">Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).</li><li>Wrobel, K., Caruso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+procedures+for+characterization+of+arsenic+and+selenium+species+in+complex+samples+utilizing+coupled+techniques+with+mass+spectrometric+detection.">Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection.</a> Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).</li><li>McCarthy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbamylation+of+proteins+in+2-D+electrophoresis--myth+or+reality.">Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality.</a> J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).</li><li>Chafey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+beta-catenin+activation+in+mouse+liver+by+DIGE+analysis+identifies+glucose+metabolism+as+a+new+target+of+the+Wnt+pathway.">Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway.</a> Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).</li><li>Kahn, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analysis+of+blood+eosinophils+reveals+redox+signaling+modifications+in+patients+with+FIP1L1-PDGFRA-associated+chronic+eosinophilic+leukemia.">Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia.</a> J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).</li><li>Pottiez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+electrophoresis-+and+chromatography-based+determination+of+gene+expression+profiles+in+bovine+brain+capillary+endothelial+cells+after+the+re-induction+of+blood-brain+barrier+properties.">A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties.</a> Proteome Sci. 8, 57 (2010).</li><li>Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+2D+Gel+Electrophoresis+with+Immobilized+pH+Gradients:+IPG+Strip+Equilibration.">Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration.</a> CSH Protoc. , (2006).</li><li>Azimzadeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics.">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+p16-Arc+subunit+of+the+Arp+2/3+complex+as+a+substrate+of+MAPK-activated+protein+kinase+2+by+proteomic+analysis.">Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis.</a> J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+thiourea+to+increase+the+solubility+of+membrane+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis.">Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).</li><li>Molloy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+membrane+proteins+by+differential+solubilization+for+separation+using+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).</li><li>Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protein+extraction+from+cryopreserved+brain+tissue+samples.">Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples.</a> Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).</li><li>Shaw, M. M., Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.</a> Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+solubilization+for+the+analysis+of+the+CD14+human+monocyte+membrane+proteome+using+LC-MS/MS.">Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS.</a> J Proteomics. 73, 112-122 (2009).</li><li>Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteome+analysis+of+the+preeclamptic+placenta+using+optimized+protein+extraction.">Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).</li><li>Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+zwitterionic+detergent+in+two-dimensional+gel+electrophoresis+of+trout+liver+microsomes.">The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes.</a> Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).</li><li>Schindowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+tau+neuropathology+leads+to+memory+deficits+and+loss+of+functional+synapses+in+a+novel+mutated+tau+transgenic+mouse+without+any+motor+deficits.">Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits.</a> Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).</li><li>Veenstra, T. D., Marcus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+advancement+of+neuroproteomics.">Multidimensional advancement of neuroproteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).</li><li>Hernandez-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+dystrophy+CTG+expansion+affects+synaptic+vesicle+proteins,+neurotransmission+and+mouse.">Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse.</a> 136, 957-970 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+staging+of+synucleinopathy+and+amyloid+deposition+in+dementia+with+Lewy+bodies.">Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).</li><li>Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+is+a+pathological+event+not+associated+with+impairment+of+proteasome+function.">Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function.</a> J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer's+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach.">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).</li><li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia:+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment.">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li><li>Leboucher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+on+tau+pathology+are+independent+of+insulin+resistance+in+tau+transgenic+mice.">Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice.</a> Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+neuropathological,+and+biochemical+characterization+of+the+novel+tau+mutation+P332S.">Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S.</a> J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).</li><li>Bell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+a+twenty-first+century+brain+bank:+experience+in+the+BrainNet+Europe+consortium.">Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium.</a> Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).</li><li>Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+human+postmortem+brain+using+2-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+(2-D+DIGE).">Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE).</a> Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).</li><li>Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+difference+gel+electrophoresis.">Two-dimensional difference gel electrophoresis.</a> Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).</li><li>Tannu, N. S., Hemby, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling.">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li></ol>

Entdecken pathologischen Expression von Proteinen, die Suche nach Biomarkern und die Modulation der möglichen Pfade für pharmakologische Targets gehören zu den Zielen der Neuroproteomics 30 nähert. Unter den Schwellenwerkzeuge, ergänzt das Feld 2DE eine vielversprechende Erwartungs. Dennoch sollte ein Konsens, um die Variabilität zu minimieren und die Reproduzierbarkeit der Experimente erreicht werden. Entsprechend dieser Idee ein standardisiertes Protokoll, um 2D-DIGE (Abbildung 2) und...

Psychische und neurologische Störungen repräsentieren 13% der globalen Krankheitslast, müssen neue Herausforderungen wie die pathophysiologischen Mechanismen, Risikofaktoren und Biomarker erforscht prodromal 1 werden. Im Einklang mit diesem Ziel, Proteomik-Studien des menschlichen Gehirns unverzichtbar geworden, um molekulare Signalwege in Prozesse wie Gedächtnis, Verhalten, Emotionen und neuronale Plastizität zum Beispiel, nicht nur für die physiologische, sondern auch für pathologische Zustände beteiligt aufzudecken. Daher ist die Verwendung von Tiermodellen und insbesondere die transgenen Mäuse, bringt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um die Entstehung von menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen 2 nachzuahmen. Proteomics Ansätze sind, um diese neue Perspektiven im Bereich der Neurowissenschaften zu erreichen heutzutage. Zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) ist ein potenter und wahrscheinlich einfache Methode, um das Proteom von einer Vielzahl von Proben vergleichen können. Darüber hinaus ist es auch eineleistungsfähige Methode, um ein Protein aus einem komplexen Gemisch, um zu identifizieren und zu isolieren, weiter zu analysieren, durch Massenspektrometrie. Diese Technik besteht im wesentlichen in zwei aufeinanderfolgenden Stufen: 1) Proteintrennung nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) von Isoelektrofokussierung (IEF). Genauer gesagt, wird ein elektrisches Potential über die Immobilin Acrylamid Streifen unter einem pH-Gradienten aufgetragen und dann Proteine ​​wandern und sich auf einen bestimmten pI in Abhängigkeit von ihrer globalen Nettoladung. 2) isoelektrisch fokussiert Proteine ​​denaturiert und negativ durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS geladen), wodurch Proteine ​​in ihrer ersten Struktur werden je nach ihrem scheinbaren Molekulargewicht (MW) von SDS-PAGE 3 getrennt. Diese zwei unterschiedlichen Eigenschaften ermöglichen es uns, einen double-Wert, weiter in der Studie des Proteoms gehen zu bewältigen. Auf der einen Seite dieser Ansatz bietet die Möglichkeit, eine quantitative Analyse mit minimalen Farbstoffe 2D-DIGE-Verfahren durchzuführen, und auf der anderen Seite ein qualitaive Analyse von Mini-2DE zu Western-Blot gekoppelt. Quantitative Analyse von 2D-DIGE verleiht Protein-Expression ändert sich über die Probe Proteom. Kurz gesagt werden Proben mit drei Cyanine (Cy2, Cy3 und Cy5) Emission bei drei verschiedenen Wellenlängen (blau, grün und rot) markiert. Diese Fluor minimal Farbstoffe N-Hydroxy Succinimidylester-Gruppe enthaltenden reagieren mit der ε-Aminogruppe der Lysinreste von Proteinen, was zu kovalenter Amid-Bindungen 4. Lysinreste werden nur zwischen 1-3% und damit verhindert, dass mehrere Etiketten zusätzlich pro Protein und die wichtigsten Änderungen der Nettoladung 5, 6 gekennzeichnet. Cy3 und Cy5 werden oft verwendet, um zwei unabhängige Stichproben zu kennzeichnen, während Cy2 Tags eine Mischung aus gleichen Teilen der Proben zu vergleichen. Die beiden wichtigsten Vorteile sind, dass alle markierten Proben werden gemischt und IEF und SDS-PAGE sind in ein Gel auf einmal für jeden Schritt durchgeführt, die Vermeidung der inter Variabilität unter Experimente durch Vergleich geliert. Darüber hinaus stellt es eine hohe Detektionsschwelle von rund 1 Femtomol von Protein 7. Gele werden gescannt und 2D-Software vergleicht die 2D-Gel-Fluoreszenzbilder, wo Cy2 dient als interner Standard, die eine Identifizierung der statistischen Unterschiede zwischen den Stellen für ihren hinteren Identifizierung durch Massenspektrometrie. Das 2D-Analyse-Software mit dem internen Standard erreicht eine schnelle Erkennung von weniger als 10% der Unterschiede zwischen den Proben mit mehr als 95% der statistischen Vertrauens 8. Qualitative Analyse von Mini-2DE ist ein entscheidender Schritt für die Proteincharakterisierung. Das Prinzip ist das gleiche, wie zuvor für PI-und MW-Trennung beschrieben, aber in diesem Fall Proteine ​​werden von einer kleinen Polyacrylamid-Gel auf eine Membran übertragen und Immunoblot wird danach durchgeführt. Während einer Dimension Gelelektrophorese stellt Veränderungen in der Proteinexpression für ein oder mehrere Protein-Epitope in Funktion des Antikörpers, der INFORMATIOn von Mini-2DE verleiht mit zwei zusätzlichen Parametern. Erstens ändern die Protein isovariants in Abhängigkeit von der pI, die anzeigt, dass post-translationale Modifikationen stattfinden könnten. Zweitens kann die Massenspektrometrie Identifizierung bezeichnend für plausibel Zymogene und Abbauprodukte von Proteinen sein. Daher sind durch 2D-DIGE beobachtet Modifikationen wahrscheinlich ein Indikator für die zugrunde liegenden Mechanismen Veränderungen in der globalen Proteom-Profil. Alignments von Immunoblots unter mehreren Proben für das gleiche Protein-Epitop / s Mini-2DE kann Säure Veränderungen beleuchten in post-translationale Variationen etwas beobachtet oder gar nicht von eindimensionalen Immunoblotting 9, 10 reflektieren. Darüber hinaus informiert diese Analyse über die möglichen Spaltstellen aufgrund der Kenntnis des pI und MW der Stoffwechselrückstände 11,12. Die Kombination dieser beiden Techniken eine komplementäre Proteomik-Analyse. Auf der einen Seite 2D-DIGE bietet einen typ.e von Unterschieden ermöglicht eine präzise Trennung von Polypeptiden, deren Expression ist anders. Diese Unterschiede bestehen im wesentlichen in das Auftreten oder Verschwinden eines Flecks oder Zunahme / Abnahme der Intensität einer durch eine Software-Analyse der Fluoreszenz Gele. Jedoch sind diese Beobachtungen selbst kaum die Natur der beobachteten Änderung erklären. Aus diesen Gründen einmal das Polypeptid isoliert und durch Massenspektrometrie identifiziert, die Verwendung von Mini-2DE ermöglicht, genau zu bestätigen 1) die Identität des Proteins isoliert und 2) die Art der Unterschied: Änderung in der isovariant / Isoform Niveau Expression, posttranslationale Modifikationen und Spaltprozesse zum Beispiel. Jedoch ist es notwendig, einen Ausgangs Lysepuffer sowohl 2D-DIGE und mit Mini-2DE kompatibel sein, um die möglichen Dispersionen durch die Verwendung von Extraktionsprotokollen, die sehr unähnlich zu begrenzen entwickeln. In dem vorliegenden Artikel werden wir debeschrieben eine angepasste Protokoll für die Vorbereitung, Extraktion und die Leistung der 2D-DIGE und Mini-2DE Techniken zur Gehirnproteine ​​aus humanen und Maus-Gewebe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">25-8010-65</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Immobiline DryStrip</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval/size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPG Buffer, pH X-X</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval desired</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&#160;</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">551797N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td>17-1335-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9334-92</td>
			<td>Plastic box to make the passive rehydration&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">MILLEX GS Filter</td>
			<td style="width:113px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the MW to separate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPGphor III Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">11-0033-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">80-6485-08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">P2D1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting

Zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Proteom Änderungen möglicherweise zu verschiedenen physiologischen oder pathologischen Bedingungen im Zusammenhang aufzudecken. Grundsätzlich ist dieses Verfahren auf die Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt in einem ersten Schritt, und zum anderen nach ihrem Molekulargewicht durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf. In diesem Bericht ein optimiertes Protokoll für die Probenvorbereitung kleine Menge von menschlichen post-mortem Hirngewebe und Maus beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht es, sowohl die Fluoreszenzdifferenz-Gelelektrophorese zweidimensionalen (2D-DIGE) und Mini-2DE-Immunoblotting durchzuführen. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht es, nicht nur neue Proteine ​​und / oder Proteinmodifikationen finden in ihrem Ausdruck durch seine Kompatibilität mit Massenspektrometrie-Erkennung, sondern auch einen neuen Einblick in die Marker-Validierung. So, Mini-2DE zu Western-Blot-Genehmigungen verbunden zu identifizieren und zu validieren Post-Translationale Modifikationen, Proteine ​​Katabolismus und bietet einen qualitativen Vergleich zwischen den verschiedenen Bedingungen und / oder Behandlungen. Hier stellen wir eine Methode, um Komponenten von Proteinaggregaten in AD und Lewy-Körper-Demenz, wie der Amyloid-beta-Peptid und dem Alpha-Synuclein gefunden studieren. Unser Verfahren kann somit für die Analyse des Proteoms angepasst und unlösliche Proteine ​​extrahiert aus menschlichem Hirngewebe und Mäuse-Modellen zu. Parallel dazu kann es nützliche Informationen für die Untersuchung von molekularen und zellulären Signalwege bei neurodegenerativen Erkrankungen sowie potenzielle neue Biomarker und therapeutische Targets beteiligt sind.

Proteomics auf Hirngewebe bleibt eine Herausforderung, da keine ideale Puffer vorhanden, um 100% von Proteinen, insbesondere Membran-assoziierten Proteine ​​oder Zellskelett erholen. Der erste Satz von Experimenten wurde die Suche nach einem geeigneten Lyse-Puffer mit beiden Ansätze und der mit einem großen Panel von Protein erholen können kompatible konzentriert. Somit wurden drei Lysepuffer untersucht, um die am besten geeignete zu bestimmen. Erstens ist die gemeinsame biochemische und molekularbiologische Puff...

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Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Mit dem Theta-Burst-Protokoll zu Mechasnism der Plastizität in Individuen sich mit Fragile X-Syndrom und Autismus

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To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...