Name: consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting
Uploaded: 2014-04-10T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting at JoVE.c

עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת ליל 2, MEDIALZ, LabEx (מעבדה מצוינות תכנית, להשקיע לעתיד) וDISTALZ (פיתוח של אסטרטגיות חדשניות לגישה תחומית למחלת אלצהיימר). FJ.FG הוא כיום מלגת נמען של ANR (צרפתית הסוכנות לאומית למחקר / NeuroSplice דה טאו Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), אבל עבודה זו הייתה גם תחת התמיכה של מענק מJCCM (ספרד).

1. Homogenization והפקת חלבון סה&quot;כ מרקמת המוח אנושית ומאוסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המגון רקמת מוח. Homogenize רקמת המוח 10% (w / v) ב8 M אוריאה, 2 M thiourea ו1% w / v חיץ SDS (UTS) באמצעות זכוכית הקדר (עבור דגימות אנושיות) או homogenizer טפלון (עבור דגימות עכברים). Sonicate ב60 הרץ 30...

<ol>
	<li>Collins, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grand+challenges+in+global+mental+health.">Grand challenges in global mental health.</a> Nature. 475, 27-30 (2011).</li><li>De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Bu&#233;e, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , 449-468 (2011).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-covalent+and+covalent+protein+labeling+in+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis.</a> J Proteomics. 71, 231-244 (2008).</li><li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+DIGE+system:+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology.">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).</li><li>Westermeier, R., Scheibe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+gel+electrophoresis+based+on+lys/cys+tagging.">Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging.</a> Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).</li><li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ventral+furrow+morphogenesis:+a+proteomic+analysis.">Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis.</a> Development. 131, 643-656 (2004).</li><li>Gharbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+for+proteomic+expression+analysis+of+a+model+breast+cancer+cell+system.">Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+pathology+modulates+Pin1+post-translational+modifications+and+may+be+relevant+as+biomarker.">Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker.</a> Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).</li><li>Bretteville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+electrophoresis+of+tau+mutants+reveals+specific+phosphorylation+pattern+likely+linked+to+early+tau+conformational+changes.">Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes.</a> PLoS One. 4, 4843 (2009).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+characterization+of+paired+helical+filament-tau+from+Alzheimer's+disease:+demonstration+of+an+additional+74-kDa+component+and+age-related+biochemical+modifications.">Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications.</a> J Neurochem. 69, 834-844 (1997).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+distribution+of+phosphorylated+tau+protein+isoforms+in+Alzheimer's+and+Pick's+diseases.">Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases.</a> FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).</li><li>Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergents+and+chaotropes+for+protein+solubilization+before+two-dimensional+electrophoresis.">Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).</li><li>Wrobel, K., Caruso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+procedures+for+characterization+of+arsenic+and+selenium+species+in+complex+samples+utilizing+coupled+techniques+with+mass+spectrometric+detection.">Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection.</a> Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).</li><li>McCarthy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbamylation+of+proteins+in+2-D+electrophoresis--myth+or+reality.">Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality.</a> J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).</li><li>Chafey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+beta-catenin+activation+in+mouse+liver+by+DIGE+analysis+identifies+glucose+metabolism+as+a+new+target+of+the+Wnt+pathway.">Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway.</a> Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).</li><li>Kahn, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analysis+of+blood+eosinophils+reveals+redox+signaling+modifications+in+patients+with+FIP1L1-PDGFRA-associated+chronic+eosinophilic+leukemia.">Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia.</a> J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).</li><li>Pottiez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+electrophoresis-+and+chromatography-based+determination+of+gene+expression+profiles+in+bovine+brain+capillary+endothelial+cells+after+the+re-induction+of+blood-brain+barrier+properties.">A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties.</a> Proteome Sci. 8, 57 (2010).</li><li>Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+2D+Gel+Electrophoresis+with+Immobilized+pH+Gradients:+IPG+Strip+Equilibration.">Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration.</a> CSH Protoc. , (2006).</li><li>Azimzadeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics.">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+p16-Arc+subunit+of+the+Arp+2/3+complex+as+a+substrate+of+MAPK-activated+protein+kinase+2+by+proteomic+analysis.">Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis.</a> J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+thiourea+to+increase+the+solubility+of+membrane+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis.">Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).</li><li>Molloy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+membrane+proteins+by+differential+solubilization+for+separation+using+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).</li><li>Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protein+extraction+from+cryopreserved+brain+tissue+samples.">Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples.</a> Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).</li><li>Shaw, M. M., Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.</a> Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+solubilization+for+the+analysis+of+the+CD14+human+monocyte+membrane+proteome+using+LC-MS/MS.">Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS.</a> J Proteomics. 73, 112-122 (2009).</li><li>Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteome+analysis+of+the+preeclamptic+placenta+using+optimized+protein+extraction.">Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).</li><li>Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+zwitterionic+detergent+in+two-dimensional+gel+electrophoresis+of+trout+liver+microsomes.">The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes.</a> Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).</li><li>Schindowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+tau+neuropathology+leads+to+memory+deficits+and+loss+of+functional+synapses+in+a+novel+mutated+tau+transgenic+mouse+without+any+motor+deficits.">Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits.</a> Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).</li><li>Veenstra, T. D., Marcus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+advancement+of+neuroproteomics.">Multidimensional advancement of neuroproteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).</li><li>Hernandez-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+dystrophy+CTG+expansion+affects+synaptic+vesicle+proteins,+neurotransmission+and+mouse.">Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse.</a> 136, 957-970 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+staging+of+synucleinopathy+and+amyloid+deposition+in+dementia+with+Lewy+bodies.">Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).</li><li>Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+is+a+pathological+event+not+associated+with+impairment+of+proteasome+function.">Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function.</a> J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer's+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach.">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).</li><li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia:+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment.">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li><li>Leboucher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+on+tau+pathology+are+independent+of+insulin+resistance+in+tau+transgenic+mice.">Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice.</a> Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+neuropathological,+and+biochemical+characterization+of+the+novel+tau+mutation+P332S.">Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S.</a> J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).</li><li>Bell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+a+twenty-first+century+brain+bank:+experience+in+the+BrainNet+Europe+consortium.">Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium.</a> Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).</li><li>Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+human+postmortem+brain+using+2-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+(2-D+DIGE).">Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE).</a> Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).</li><li>Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+difference+gel+electrophoresis.">Two-dimensional difference gel electrophoresis.</a> Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).</li><li>Tannu, N. S., Hemby, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling.">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li></ol>

גילוי פתולוגיות שינויי ביטוי של חלבונים, חיפוש אחר סמנים ביולוגיים והאפנון של מסלולים אפשריים למטרות תרופתיים הם בין המטרות של neuroproteomics גישות 30. בין הכלים מתעוררים, שדה 2DE מוסיף expectative מבטיח. ובכל זאת, יש להגיע להסכמה על מנת למזער ולהגדיל את שונות שחזור בניסויים....

הפרעות נפשיות ונוירולוגיות מייצגות 13% מהנטל העולמי של מחלה, אתגרים חדשים כמו מנגנונים pathophysiological, גורמי סיכון וסמנים ביולוגיים prodromal חייבים להיחקר 1. בקנה אחד עם מטרה זו, מחקרי פרוטאומיקה של המוח האנושי הפכו הכרחיים כדי לחשוף את המסלולים מולקולריים מעורבים בתהליכים כמו זיכרון, התנהגות, רגשות ופלסטיות עצבית למשל, לא רק לפיסיולוגי, אלא גם למצבים פתולוגיים. לכן, השימוש במודלים של בעלי חיים ובאופן ספציפי יותר עכברים הטרנסגניים, מביא מגוון רחב של אפשרויות על מנת לחקות את אטיולוגיה של מחלות המוח ניווניות 2. פרוטאומיקה גישות זמינות כיום על מנת להשיג את נקודות המבט חדשים בתחום מדעי המוח. אלקטרופורזה דו ממדי ג&#39;ל (2DE) היא שיטה פשוטה ורבה עוצמה סבירה, המאפשרת להשוות את proteome של מגוון רחב של דוגמאות. יתר על כן, הוא גםשיטה רבת עוצמה לבודד את חלבון מתערובת מורכבת על מנת לזהות ולנתח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה. טכניקה זו בעצם מורכבת בשני שלבים רצופים: 1) הפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית (PI) על ידי isoelectrofocusing (IEF). לייתר דיוק, פוטנציאל חשמלי מוחל על פני רצועות acrylamide immobiline בין שיפוע pH ולאחר מכן החלבונים יעברו ולהתמקד בפיי נחוש בפונקציה של מטען נטו הגלובלי שלהם. 2) חלבוני Isoelectrically ממוקדים הם מפוגלים ומטען שלילי על ידי התוספת של נתרן גופרתי dodecyl (SDS), ובכך חלבונים במבנה הראשון שלהם מופרדים בהתאם למשקל המולקולרי לכאורה שלהם (MW) על ידי-SDS 3. שני מאפיינים ייחודיים אלה מאפשרים לנו להתמודד עם ערך כפול ללכת רחוק יותר במחקר של proteome. מצד אחד גישה זו מציעה את האפשרות לבצע ניתוח כמוני באמצעות צבעים מינימאליים שיטת 2D-DIGE, ומצד שני qualitativניתוח דואר על ידי מיני 2DE מצמידים מערבי סופג. ניתוח כמותי של 2D-DIGE מעניק ביטוי חלבון משתנה בכל רחבי proteome המדגם. בקצרה, דגימות מסומנות עם שלוש cyanines (Cy2, Cy3 וCy5) פולטת בשלושה אורכי גל שונים (כחול, ירוק ואדום). צבעים מינימאליים פלואוריד אלה המכילים קבוצת succinimidyl אסתר N-הידרוקסי מגיבים עם קבוצת ε-אמינו של שאריות lysines של חלבונים וכתוצאה מכך אגרות חוב אמיד קוולנטיים 4. שאריות ליזין מסומנות רק בין 1-3% ובכך מונע בנוסף תוויות מרובות לכל חלבון ושינויים גדולים תשלום נטו 5, 6. Cy3 וCy5 משמשים לעתים קרובות כדי לתייג את שני מדגמים בלתי תלויים ואילו Cy2 תגי תמהיל שלהן משקל שווה בדגימות כדי להשוות. שני היתרונות העיקריים הם כי כל הדגימות שכותרתו הן מעורבות וIEF ו- SDS מתבצעים בג&#39;ל אחד בפעם אחת לכל שלב, תוך הימנעות מהשתנות היתר בקרב ניסויים בשל ג&#39;לי השוואה. יתר על כן, הוא מציג סף זיהוי גבוה של כ 1 femtomole של חלבון 7. ג&#39;לים נסרקים ותוכנת 2D משווה את תמונות 2D ג&#39;ל הקרינה, שבו Cy2 משמשת כתקן המאפשר זיהוי של הבדלים סטטיסטיים בין הכתמים לזיהוי האחורי שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה פנימי. תוכנת ניתוח 2D באמצעות התקן הפנימי משיגה זיהוי מהיר של פחות מ -10% מהבדלים בין דגימות עם יותר מ 95% של ביטחון סטטיסטי 8. ניתוח איכותני על ידי מיני 2DE הוא צעד חיוני לאפיון חלבונים. העיקרון הוא אותו כפי שתואר לעיל עבור PI והפרדת MW, אבל במקרה הזה חלבונים מועברים מג&#39;ל polyacrylamide קטן קרום וimmunoblotting מתבצע לאחר מכן. בעוד ג&#39;ל אלקטרופורזה ממד אחד מספקת שינויים בביטוי חלבונים לאחד או כמה אפיטופים חלבון בתפקוד של הנוגדן, information של מיני 2DE מעניק עם שני פרמטרים נוספים. ראשית, isovariants חלבון השינוי בתפקוד של פיי, המצביע על כך שלאחר translational שינויים עשויים להתרחש. שנית, זיהוי ספקטרומטריית מסה עשויה להצביע על zymogens הסביר ומוצרים קטבולי של חלבונים. לכן, שינויים שנצפו על ידי 2D-DIGE צפויים מעיד על המנגנונים העומדים בבסיס שינויים בפרופיל proteome הגלובלי. מערכים של immunoblots בין כמה דוגמאות מאותה epitope החלבון / s על ידי מיני 2DE עשויים לשקף שינויי חומציות לשפוך אור לתוך וריאציות לאחר translational מעט נצפו או אפילו לא על ידי immunoblotting monodimensional 9, 10. יתר על כן, ניתוח זה מודיע על אתרי מחשוף הפוטנציאליים בשל הידע של הצרכן וMW של השאריות מטבולי 11,12. השילוב של שתי טכניקות אלה מספק ניתוח פרוטאומיקה משלים. מצד אחד 2D-DIGE מקנה typדואר של הבדלים המאפשרים בידוד מדויק של פוליפפטידים הביטוי שלו הוא שונה. הבדלים אלה כוללים למעשה להופעה או ההיעלמות של נקודה או עלייה / ירידה של עוצמת נתון אחד על ידי ניתוח תוכנה של ג&#39;לי הניאון. עם זאת, התצפיות הללו על ידי עצמם הן סבירה כדי להסביר את טיבו של השינוי שנצפה. מסיבות אלה, ברגע שפוליפפטיד בודד וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה, השימוש במיני 2DE מאפשר לאשר 1 בדיוק) את זהותו של החלבון מבודד ו2) טבעו של ההבדל: השינוי ברמת isovariant / איזופורם של ביטוי, שלאחר translational שינויים ותהליכי מחשוף למשל. עם זאת, יש צורך לפתח את מאגר תמוגה מתחיל שניהם בקנה אחד עם 2D-DIGE ועם מיני 2DE על מנת להגביל תפוצות הפוטנציאליות הנובעות מהשימוש בפרוטוקולי חילוץ כי הם מאוד שונים. במאמר הנוכחי, אנחנו דהשתואר בפרוטוקול מותאם להכנה, החילוץ וביצועים של 2D-DIGE וטכניקות מיני 2DE לחלבונים במוח מגיעים מהרקמה אנושית ועכבר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">25-8010-65</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Immobiline DryStrip</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval/size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPG Buffer, pH X-X</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval desired</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&#160;</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">551797N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td>17-1335-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9334-92</td>
			<td>Plastic box to make the passive rehydration&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">MILLEX GS Filter</td>
			<td style="width:113px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the MW to separate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPGphor III Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">11-0033-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">80-6485-08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">P2D1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting

ג&#39;ל אלקטרופורזה דו ממדים (2DE) היא כלי רב עוצמה כדי לגלות שינויי proteome פוטנציאליות הקשורים לתנאים פיסיולוגיים או פתולוגי שונים. בעיקרון, טכניקה זו מבוססת על הפרדת החלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית בשלב ראשון, ושנית על פי המשקלים המולקולריים שלהם על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide SDS (SDS-PAGE). בדוח זה מדגם פרוטוקול הכנה מותאם לכמות קטנה של רקמה שלאחר המוות ומוח עכבר אנושי מתואר. שיטה זו מאפשרת לבצע שתי אלקטרופורזה דו ממדי הבדל הקרינה ג&#39;ל (2D-DIGE) וimmunoblotting 2DE המיני. השילוב של גישות אלו מאפשר לאדם למצוא לא רק חלבונים חדשים ו / או שינויים בחלבון בזכות הביטוי שלהם לתאימות שלה עם זיהוי ספקטרומטריית מסה, אלא גם תובנה חדשה אימות סמנים. לפיכך, מיני 2DE מצמידים את ההיתרים מערביים סופג לזהות ולאמת את הודעה-Translational שינויים, פירוק חלבונים ומספק השוואה איכותית בין תנאים ו / או טיפולים שונים. בזאת, אנו מספקים שיטה ללמוד רכיבים של אגרגטים חלבון שנמצאו בספירה ודימנציה גופיפי לוי כגון פפטיד עמילואיד בטא ואלפא סינוקלאין. השיטה שלנו ובכך ניתן להתאים לניתוח proteome וחלבונים מסיסים לחלץ מדגמי רקמת המוח ועכברים אנושיים מדי. במקביל, היא עשויה לספק מידע שימושי לחקר מסלולים מולקולריים ותאיים המעורבים במחלות ניווניות כמו גם סמנים ביולוגיים רומן פוטנציאליים ומטרות טיפוליות.

פרוטאומיקה על רקמת המוח נותרת מאתגרת שכן אין חיץ אידיאלי קיים כדי להתאושש מחלבונים 100%, במיוחד קרום הקשורים או חלבוני שלד תא. הסט הראשון של ניסויים שהתמקדו בחיפוש אחר מאגר תמוגה מתאים תואם את שתי גישות ואשר מאפשרת לשחזר את פנל גדול של חלבון. לפיכך, שלושה מאגרי תמוגה הי?...

Watch this Scientific Journal Video about Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting at JoVE.c

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: שימוש בפרוטוקול תטא-Burst לחקור Mechasnism של פלסטיות של אנשים עם תסמונת X שביר אוטיזם ו

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

ברזולוציה גבוהה<em&gt; In vivo</em&gt; פרוטוקול פילוח ידני לאדם בהיפוקמפוס תת תחומים באמצעות הדמיה בתהודה מגנטית 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

New Methods to Study Gustatory Coding

שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting