Name: consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting
Uploaded: 2014-04-10T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting at JoVE.c

이 작품은 INSERM, 릴 2의 대학에 의해 지원되었다, MEDIALZ, LabEx (우수 실험실, 프로그램은 미래에 대한 투자) 및 DISTALZ (알츠하이머 병에 대한 학문적 접근을위한 혁신적인 전략의 개발). FJ.FG 현재 ANR (프랑스 국립 연구 기관 / NeuroSplice 드 타우 01 인텔리 ANR-2010-BLAN-1114)의받는 사람의 교제이지만,이 작품은 JCCM (스페인)에서 교부금의 지원 아래도했다.

1. 균질화 및 인간과 쥐의 뇌 조직에서 총 단백질 추출 <ol><li> 뇌 조직 균질화. (인간의 샘플) 도공 유리 또는 (쥐 샘플) 테플론 균질화를 사용하여 뇌 조직의 10 % (W / V) 8 M 요소에, 2 M 티오 및 W / V SDS 버퍼 (UTS) 1 % 균질화한다. 60 Hz에서 전체 조직의 분해 (13, 14)에 0.5 초를 적용하는 초음파 발생기 (30) 펄스에서 초음파 처리. <ol><li> 표준으로 BSA를 사용하여, 브래드 포드 분석과 단백질 농도를 ?...

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	<li>Collins, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grand+challenges+in+global+mental+health.">Grand challenges in global mental health.</a> Nature. 475, 27-30 (2011).</li><li>De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Bu&#233;e, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , 449-468 (2011).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Riederer, B. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling.">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li></ol>

단백질의 병리학 적 발현 변화를 발견, 생체에 대한 검색 및 약물 표적에 대한 잠재적 인 경로의 변조 neuroproteomics의 목적 중입니다 (30)에 접근한다. 새로운 도구 가운데, 2DE 필드는 유망한 expectative을 추가합니다. 그럼에도 불구하고, 합의 변동을 최소화하고 실험의 재현성을 높이기 위해 도달되어야한다. 이 아이디어의 라인에서 2D-DIGE (그림 2)와 모노 차원 면역 블롯과 완벽?...

정신 및 신경 장애는 질병의 글로벌 부담의 13 %를 나타냅니다, 병태 생리 학적 메커니즘, 위험 요소 및 구성 (prodromal) 바이오 마커와 같은 새로운 도전 1 탐구해야합니다. 이 목적에 부합하는, 인간의 뇌의 단백질 체학 연구는 생리에 대한뿐만 아니라 병적 인 조건뿐만 아니라 메모리, 행동, 감정과 예를 들어 신경 세포의 가소성, 같은 프로세스에 관련된 분자 경로를 발견하기 위해 필수가됩니다. 따라서, 동물 모델의 사용 및보다 구체적으로 형질 전환 마우스는 인간의 신경 퇴행성 질환의 병인이 모방하는 광범위한 가능성을 가져온다. 프로테오믹스 방법은 신경 과학 분야에서 이러한 새로운 관점을 달성하기 위해 요즘 사용할 수 있습니다. 이차원 전기 영동 (2DE)는 시료의 넓은 범위의 프로테옴을 비교할 수 유력한 것으로 간단한 방법이다. 또한,도식별하기 위해 복잡한 혼합물로부터 단백질을 분리하고 추가로 질량 분석법에 의해 분석하기위한 강력한 방법. (IEF)을 isoelectrofocusing하여 자신의 등전점 (PI)에 따라 1) 단백질의 분리 :이 기술은 기본적으로 두 개의 연속적인 단계로 구성되어 있습니다. 보다 정확하게는, 전위의 pH 구배 구비 immobiline 아크릴 아미드 스트립을 가로 질러인가 된 후 단백질은 이주 및 글로벌 넷 충전 기능 판정의 pI에 초점을 맞출 것이다. 2) Isoelectrically 집중된 단백질은 첫 구조하여 단백질이 SDS-PAGE (3)에 의해 그들의 겉보기 분자량 (MW)에 따라 구분되며) 변성하고 부정적인 도데 실 황산나트륨 (SDS의 첨가에 의해 부과. 이 두 가지 속성은 우리가 프로테옴의 연구에 더 갈 수있는 두 값을 해결 할 수 있습니다. 한편이 방법은 최소한의 염료 2D-DIGE 방법을 사용하여 정량 분석​​을 수행 할 수있는 가능성을 제공하고, 반면에 qualitativ미니 2DE에 의해 전자의 분석은 웨스턴 블로 팅에 결합. 2D-DIGE에 의한 정량 분석​​ 단백질 발현은 모든 샘플의 프로테옴에 변경 수여한다. 간단히 샘플은 세 개의 서로 다른 파장 (블루, 그린, 레드)에 발광 세 시아닌 (CY2,를 Cy3와 Cy5에)로 표시되어 있습니다. N-히드 록시 숙신 이미 딜 에스테르기를 함유 한 불소 최소한 염료는 공유 결합, 아미드 결합 소재 얻어진 단백질의 리신 잔기의 ε-아미노 그룹과 반응한다. 리신 잔류 물은 1 ~ 3 % 사이 따라서 단백질에 여러 라벨 또한 주요 그물 충전 수정 5, 6을 방지 표시되어 있습니다. 를 Cy3와 Cy5에 자주 CY2 비교할 샘플의 동일한 비율의 혼합에 태그를하는 동안 두 개의 독립적 인 샘플을 레이블로 사용됩니다. 두 가지 주요 이점은 모든 표지 샘플 혼합하고 IEF 및 SDS-PAGE 젤이 비교에 의한 실험들 간 변동을 피하기 위해, 각 단계에 대해 한 번에 한 겔에서 실시되어있다. 또한, 단백질 7의 약 1 femtomole의 높은 탐지 임계 값을 제공한다. 젤 스캔 및 2D 소프트웨어는 CY2는 질량 분석에 의해 그들의 후방 식별을위한 관광 명소 중 통계적 차이의 식별을 허용하는 내부 표준으로 제공하는 2D 겔의 형광 이미지를 비교하고 있습니다. 내부 표준을 사용하여 2 차원 분석 소프트웨어 통계적 신뢰도 8의 95 % 이상과 샘플 사이의 차이의 10 % 미만의 빠른 검출을 달성한다. 미니 2DE 질적 분석은 단백질 특성 분석을위한 중요한 단계입니다. 원리는 이전 pi에서 MW 분리 설명한 것과 동일하지만,이 경우에는 단백질이 막에 작은 폴리 아크릴 아미드 겔로부터 전송 및 면역 블 롯팅은 나중에 수행된다. 하나의 차원 겔 전기 영동은 하나의 항체 기능, 정보 출력 여러 단백질 에피토프에 대한 단백질 발현의 변화를 제공하는 반면미니 2DE에서 북쪽으로 두 개의 추가 매개 변수를 부여한다. 첫째, 단백질 isovariants은 번역 후 변형이 일어날 수 있음을 나타내는 파이의 기능에 변경합니다. 둘째, 질량 분석 식별 그럴듯 zymogens과 단백질의 이화 작용 제품을 나타낼 수있다. 따라서, 2D-DIGE 관찰 수정이 글로벌 프로테옴 프로파일의 변화를 기본 메커니즘을 나타내는 것 같다. 미니 2DE하여 동일한 단백질 에피토프 / S에 대한 몇 가지 샘플들 사이 면역 블롯의 선형은 산도가 약간 관찰 번역 후 변형에 빛을 흘리는 변경 또는하지 monodimensional 면역 블롯 (9, 10)에 의해 반영 될 수 있습니다. 또한,이 분석은 대사 잔기 11,12의 파이 및 MW의 기술에 의한 전위 절단 부위에 대해 알려준다. 이들 두 기술의 조합은 상보 단백질 체학 분석을 제공한다. 한편 2D-DIGE은 일반 가르치시표정이 다른 폴리 펩타이드의 정확한 분리를 허용 차이의 전자. 이러한 차이는 지점 또는 형광 젤의 소프트웨어 분석에 의해 주어진 하나의 강도의 증가 / 감소의 비 표시로 기본적으로 구성되어 있습니다. 그러나, 그 자체로 이러한 관찰은 관찰 변형 예의 본질을 설명 할 확률이다. 의 isovariant / 이소 형 수준의 변화 : 폴리펩티드를 단리하고 질량 분석에 의해 식별되면 이러한 이유로, 미니 2DE의 사용)는 정확하게 하나를 확인하기 위하여 절연 단백질의 정체성과 차이의 2) 자연있게 예를 들어 표현, 번역 후 변형 및 절단 과정. 그러나, 매우 비슷하다 추출 프로토콜의 사용으로 인해 잠재적 분산액을 제한하기 위해 2D-DIGE 가진 미니 2DE 호환 모두 시작 용해 완충액을 개발하는 것이 필요하다. 본 문서에서는, 우리는 드2D-DIGE 인간 및 마우스 조직에서 오는 뇌 단백질 미니 2DE 기술의 준비, 추출 및 성능에 대한 적응 프로토콜을 스 크라이 빙.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">25-8010-65</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Immobiline DryStrip</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval/size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPG Buffer, pH X-X</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval desired</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&#160;</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">551797N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td>17-1335-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9334-92</td>
			<td>Plastic box to make the passive rehydration&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">MILLEX GS Filter</td>
			<td style="width:113px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the MW to separate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPGphor III Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">11-0033-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">80-6485-08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">P2D1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting

이차원 전기 영동 (2DE)는 잠재적으로 다른 생리적 또는 병리 적 조건과 관련 프로테옴 수정 사항을 발견 할 수있는 강력한 도구입니다. 기본적으로,이 기술은 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 제 1 단계에서 그들의 등전점에 따라 단백질을 분리하고, 둘째 그 분자량에 따른에 기초한다. 이 보고서에서 인간의 사후와 마우스 뇌 조직의 작은 금액에 대한 최적화 된 샘플 준비 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 두 개의 차원 형광 차이 겔 전기 영동 (2D-DIGE) 미니 2DE의 면역 블롯을 수행 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식의 조합은 하나의 질량 분석 검출과의 호환성 발현 덕분에 새로운 단백질 및 / 또는 단백질의 변형을 찾을뿐만 아니라 수 있지만, 또한 마커 검증에 새로운 통찰력. 따라서, 미니 2DE은 포스트를 확인하고 검증하기 위해 서부 블로 팅 허가에 결합번역 후 수정, 단백질 이화 작용과 다른 조건 및 / 또는 치료 사이에 질적 인 비교를 제공합니다. 여기서, 우리는 아밀로이드 - 베타 펩티드와 알파 synuclein으로 AD와의 Lewy 몸 치매에있는 단백질 집합체의 구성 요소를 공부하는 방법을 제공한다. 우리의 방법은 이와 같이 프로테옴의 분석을 위해 적응 될 수 불용성 단백질은 인간의 뇌 조직 및 마우스 모델에서 추출한다. 병렬에서는 퇴행성 신경 질환뿐만 아니라 잠재적 인 새로운 바이오 마커 및 치료 표적에 관련된 분자 및 세포 경로의 연구를위한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다.

제공된 이상적인 버퍼 단백질의 100 %, 특히 막 - 연관 또는 세포 골격 단백질을 복구하기 위해 존재하지 않기 때문에 뇌 조직에 프로테오믹스 도전 남아있다. 실험의 첫 번째 세트는 단백질의 대형 패널을 복구 할 수 있도록 두 개의 접근법과 호환 적합한 용해 버퍼의 검색에 집중 하였다. 따라서, 세 용해 버퍼는 가장 적절한 하나를 결정하기 위해 분석 하였다. 첫째, 그것은 1 %와 10 밀리미터 (W / V)...

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Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS : 연약한 X 증후군 및 자폐증과 개인의 소성의 Mechasnism를 탐험하는 세타 - 버스트 프로토콜을 사용하여

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

연구

신경과학

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

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의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

연속 신경 근육 분기점에서 싱글 Schwann 세포를 윤곽을 그리다하는 사진 표백

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

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소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

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높은 해상도<em&gt; 생체</em&gt; 3T 자기 공명 영상을 이용하여 인간의 해마 서브 필드에 대한 수동 분할 프로토콜

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

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모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

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간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

New Methods to Study Gustatory Coding

새로운 방식으로 맛보기 코딩 공부하기

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

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Drosophila 섬 분석 결과에서 운전 행동의 높은 처리량 분석

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...