Name: consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting
Uploaded: 2014-04-10T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting at JoVE.c

Dette arbeidet ble støttet av INSERM, Universitetet i Lille 2, MEDIALZ, LABEX (excellence laboratorium, program investere for fremtiden) og DISTALZ (utvikling av innovative strategier for en tverrfaglig tilnærming til Alzheimers sykdom). FJ.FG er for tiden en mottaker fellesskap av ANR (French National Research Agency / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), men dette arbeidet var også under støtte av et stipend fra SMM (Spania).

En. Homogenisering og Total Protein Utvinning fra Menneske og mus hjernevev <ol><li> Hjernevev homogenisering. Homogenisere hjernevevet 10% (w / v) i 8 M urea, 2 M tiourea og 1% w / v SDS buffer (UTS) ved hjelp av en rote-glass (for humane prøver) eller teflon homogenisator (for muse prøver). Sonicate ved 60 Hz 30 pulser med en ultralydgenerator anvende 0,5 sek for total oppløsning vev 13, 14.. <ol><li> Bestem proteinkonsentrasjonen med Bradford-analysen ved bruk av BSA som standard. Dette UTS buffer eks...

<ol>
	<li>Collins, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grand+challenges+in+global+mental+health.">Grand challenges in global mental health.</a> Nature. 475, 27-30 (2011).</li><li>De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Bu&#233;e, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , 449-468 (2011).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-covalent+and+covalent+protein+labeling+in+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis.</a> J Proteomics. 71, 231-244 (2008).</li><li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+DIGE+system:+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology.">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).</li><li>Westermeier, R., Scheibe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+gel+electrophoresis+based+on+lys/cys+tagging.">Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging.</a> Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).</li><li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ventral+furrow+morphogenesis:+a+proteomic+analysis.">Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis.</a> Development. 131, 643-656 (2004).</li><li>Gharbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+for+proteomic+expression+analysis+of+a+model+breast+cancer+cell+system.">Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+pathology+modulates+Pin1+post-translational+modifications+and+may+be+relevant+as+biomarker.">Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker.</a> Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).</li><li>Bretteville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+electrophoresis+of+tau+mutants+reveals+specific+phosphorylation+pattern+likely+linked+to+early+tau+conformational+changes.">Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes.</a> PLoS One. 4, 4843 (2009).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+characterization+of+paired+helical+filament-tau+from+Alzheimer's+disease:+demonstration+of+an+additional+74-kDa+component+and+age-related+biochemical+modifications.">Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications.</a> J Neurochem. 69, 834-844 (1997).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+distribution+of+phosphorylated+tau+protein+isoforms+in+Alzheimer's+and+Pick's+diseases.">Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases.</a> FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).</li><li>Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergents+and+chaotropes+for+protein+solubilization+before+two-dimensional+electrophoresis.">Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).</li><li>Wrobel, K., Caruso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+procedures+for+characterization+of+arsenic+and+selenium+species+in+complex+samples+utilizing+coupled+techniques+with+mass+spectrometric+detection.">Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection.</a> Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).</li><li>McCarthy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbamylation+of+proteins+in+2-D+electrophoresis--myth+or+reality.">Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality.</a> J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).</li><li>Chafey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+beta-catenin+activation+in+mouse+liver+by+DIGE+analysis+identifies+glucose+metabolism+as+a+new+target+of+the+Wnt+pathway.">Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway.</a> Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).</li><li>Kahn, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analysis+of+blood+eosinophils+reveals+redox+signaling+modifications+in+patients+with+FIP1L1-PDGFRA-associated+chronic+eosinophilic+leukemia.">Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia.</a> J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).</li><li>Pottiez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+electrophoresis-+and+chromatography-based+determination+of+gene+expression+profiles+in+bovine+brain+capillary+endothelial+cells+after+the+re-induction+of+blood-brain+barrier+properties.">A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties.</a> Proteome Sci. 8, 57 (2010).</li><li>Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+2D+Gel+Electrophoresis+with+Immobilized+pH+Gradients:+IPG+Strip+Equilibration.">Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration.</a> CSH Protoc. , (2006).</li><li>Azimzadeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics.">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+p16-Arc+subunit+of+the+Arp+2/3+complex+as+a+substrate+of+MAPK-activated+protein+kinase+2+by+proteomic+analysis.">Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis.</a> J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+thiourea+to+increase+the+solubility+of+membrane+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis.">Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).</li><li>Molloy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+membrane+proteins+by+differential+solubilization+for+separation+using+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).</li><li>Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protein+extraction+from+cryopreserved+brain+tissue+samples.">Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples.</a> Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).</li><li>Shaw, M. M., Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.</a> Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+solubilization+for+the+analysis+of+the+CD14+human+monocyte+membrane+proteome+using+LC-MS/MS.">Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS.</a> J Proteomics. 73, 112-122 (2009).</li><li>Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteome+analysis+of+the+preeclamptic+placenta+using+optimized+protein+extraction.">Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).</li><li>Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+zwitterionic+detergent+in+two-dimensional+gel+electrophoresis+of+trout+liver+microsomes.">The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes.</a> Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).</li><li>Schindowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+tau+neuropathology+leads+to+memory+deficits+and+loss+of+functional+synapses+in+a+novel+mutated+tau+transgenic+mouse+without+any+motor+deficits.">Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits.</a> Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).</li><li>Veenstra, T. D., Marcus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+advancement+of+neuroproteomics.">Multidimensional advancement of neuroproteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).</li><li>Hernandez-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+dystrophy+CTG+expansion+affects+synaptic+vesicle+proteins,+neurotransmission+and+mouse.">Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse.</a> 136, 957-970 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+staging+of+synucleinopathy+and+amyloid+deposition+in+dementia+with+Lewy+bodies.">Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).</li><li>Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+is+a+pathological+event+not+associated+with+impairment+of+proteasome+function.">Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function.</a> J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer's+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach.">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).</li><li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia:+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment.">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li><li>Leboucher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+on+tau+pathology+are+independent+of+insulin+resistance+in+tau+transgenic+mice.">Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice.</a> Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+neuropathological,+and+biochemical+characterization+of+the+novel+tau+mutation+P332S.">Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S.</a> J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).</li><li>Bell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+a+twenty-first+century+brain+bank:+experience+in+the+BrainNet+Europe+consortium.">Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium.</a> Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).</li><li>Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+human+postmortem+brain+using+2-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+(2-D+DIGE).">Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE).</a> Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).</li><li>Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+difference+gel+electrophoresis.">Two-dimensional difference gel electrophoresis.</a> Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).</li><li>Tannu, N. S., Hemby, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling.">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li></ol>

Oppdage patologiske uttrykk endringer av proteiner, søke etter biomarkører og modulering av potensielle trasé for farmakologiske mål er blant målene for de neuroproteomics nærmer 30. Blant de nye verktøyene, den 2DE feltet gir en lovende expectative. Likevel bør en konsensus nås for å minimalisere variabiliteten og øke reproduserbarheten i eksperimentene. I tråd med denne ideen en standardisert protokoll for å utføre 2D-DIGE (figur 2) og den etterfølgende 2DE immunoblotting <st...

Psykiske og nevrologiske lidelser representerer 13% av den globale sykdomsbyrden, må nye utfordringer som patofysiologiske mekanismer, risikofaktorer og prodromal biomarkører bli utforsket en. I tråd med denne målsettingen, proteomikk studier av den menneskelige hjerne blitt uunnværlig for å avdekke molekylære stier involvert i prosesser som hukommelse, atferd, følelser og neuronal plastisitet for eksempel, ikke bare for fysiologisk, men også for patologiske tilstander. Derfor vil anvendelse av dyremodeller og mer spesifikt den transgene mus, bringer en rekke muligheter for å etterligne etiologien av human neurodegenerative forstyrrelser 2. Proteomikk tilnærminger er i dag tilgjengelig for å oppnå disse nye perspektiver i nevrovitenskap feltet. To-dimensjonal gelelektroforese (2DE) er en potent og sannsynlig enkel metode som gjør det mulig å sammenligne proteomet av et bredt spekter av prøver. Videre er det også enkraftig metode for å isolere et protein fra en kompleks blanding for å identifisere og videre analyse ved massespektrometri. Denne teknikken består i det vesentlige i to suksessive trinn: 1) proteinet separasjon i henhold til deres isoelektriske punkt (pI) ved isoelectrofocusing (IEF). Mer presist, er et elektrisk potensial som påtrykkes over immobiline akrylamid strimlene mellom en pH-gradient, og da proteinene vil migrere og fokusere på en bestemt pI i funksjon av deres globale nettoladning. 2) Isoelectrically fokusert proteiner denatureres og negativt ladet ved tilsetning av natriumdodecylsulfat (SDS), og dermed proteiner i deres første struktur separeres avhengig av deres tilsynelatende molekylvekt (MW) ved hjelp av SDS-PAGE 3.. Disse to distinkte egenskaper tillate oss å takle en dobbel verdi for å gå videre i studiet av proteomet. På den ene side er denne tilnærmingen gir muligheten for å utføre en kvantitativ analyse ved bruk av minimalt fargestoffer 2D-DIGE metode, og på den annen side en qualitative analyse av mini-2DE koblet til western blotting. Kvantitativ analyse av 2D-DIGE skjenker protein uttrykk endrer hele prøven proteomet. Kort fortalt er prøvene merket med tre cyanines (CY2, Cy3 og Cy5) emitting på tre forskjellige bølgelengder (blått, grønt og rødt). Disse fluor minimal fargestoffer inneholdende N-hydroksy-succinimidyl-ester-gruppen reagerer med ε-aminogruppen i lysines rester av proteiner som resulterer i kovalente amidbindinger 4. Lysin-rester er merket bare mellom 1-3% og derved hindre flere etiketter tillegg per protein og større nettoladning modifikasjoner 5, 6. Cy3 og Cy5 blir ofte brukt til å merke to uavhengige utvalg mens CY2 tags en blanding av lik andel av prøvene for å sammenligne. De to viktigste fordelene er at alle merkede prøver er blandet og IEF-og SDS-PAGE utføres på en gel på en gang for hvert trinn, unngår den inter variabilitet blant eksperimenter på grunn av geler sammenligning. Videre presenterer den en høy deteksjonsgrensen på rundt en femtomole av protein 7. Geler blir skannet og 2D programvaren sammen 2D gel fluorescens bilder, hvor CY2 fungerer som en indre standard for å tillate identifisering av statistiske forskjeller mellom stedene for deres bakre identifikasjon ved massespektrometri. Den 2D-analyse-programvare ved hjelp av intern standard oppnår en rask påvisning av mindre enn 10% av forskjeller mellom prøver med mer enn 95% av statistisk sikkerhet 8.. Kvalitativ analyse av mini-2DE er et viktig skritt for protein karakterisering. Prinsippet er det samme som tidligere beskrevet for pI-og MW-separasjon, men i dette tilfellet proteiner blir overført fra en liten polyakrylamidgel til en membran og immunoblotting utføres etterpå. Mens den ene dimensjon gelelektroforese gir forandringer i protein ekspresjon av en eller flere protein-epitoper i funksjon av antistoffet, på informasjonsn av mini-2DE endows med to ekstra parametre. For det første protein isovariants endres som funksjon av pI, som angir at post-translasjonelle modifikasjoner kan finne sted. For det andre kan massespektrometri identifisering være en indikasjon på plausible zymogener og katabolske produkter av proteiner. Derfor modifikasjoner observert av 2D-DIGE er sannsynlig indikasjon på mekanismene bak endringer i global proteom profil. Justeringer av immunoblots blant flere prøver for samme protein epitop / s ved mini-2DE kan gjenspeile surhet endringer Shedding lys inn posttranslasjonelle variasjoner litt observert eller selv ikke etter monodimensional immunoblotting 9, 10. Videre informerer denne analysen om de potensielle spaltningsseter grunn til kunnskap om pi og MW av de metabolske rester 11,12. Kombinasjonen av disse to teknikkene gir en komplementær proteomforskning analyse. På den ene siden 2D-DIGE gir en type av forskjeller tillater en nøyaktig isolering av polypeptider som uttrykk er forskjellig. Disse forskjeller består i det vesentlige inn i utseende eller forsvinningen av en flekk eller økning / reduksjon av intensiteten av en gitt en av programvare analyse av de fluorescerende geler. Men disse observasjonene i seg selv er lite sannsynlig å forklare innholdet i modifikasjonen observert. Av disse grunner, når polypeptidet blir isolert og identifisert ved massespektrometri, bruk av mini-2DE gjør det mulig å bekrefte nøyaktig 1) identiteten av proteinet isoleres og 2) arten av forskjellen: endring i isovariant / isoform nivå ekspresjonssystemer, post-translasjonelle modifikasjoner og cleavage prosesser for eksempel. Imidlertid er det nødvendig å utvikle et utgangs lysis buffer både kompatible med 2D-DIGE og med mini-2DE for å begrense de mulige dispersjoner som følge av bruk av ekstraksjonsmetoder som er svært forskjellige. I denne artikkelen, vi utelattbeskrevet en tilpasset protokoll for utarbeidelse, utvinning og ytelse av 2D-DIGE og mini-2de teknikker for hjerne proteiner som kommer fra mennesker og mus vev.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">25-8010-65</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Immobiline DryStrip</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval/size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPG Buffer, pH X-X</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval desired</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&#160;</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">551797N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td>17-1335-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9334-92</td>
			<td>Plastic box to make the passive rehydration&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">MILLEX GS Filter</td>
			<td style="width:113px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the MW to separate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPGphor III Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">11-0033-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">80-6485-08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">P2D1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting

To-dimensjonal elektroforese (2DE) er et kraftig verktøy for å avdekke proteom modifikasjoner potensielt knyttet til ulike fysiologiske eller patologiske tilstander. I utgangspunktet er denne teknikken basert på separasjon av proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt i et første trinn, og for det andre i henhold til deres molekylvekt ved SDS polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE). I denne rapporten en optimalisert prøvepreparering protokoll for liten mengde humant post-mortem og mus hjernevev er beskrevet. Denne metoden gjør det mulig å utføre både todimensjonal fluorescens forskjell gelelektroforese (2D-DIGE) og mini 2DE immunoblotting. Kombinasjonen av disse metodene gjør det mulig å ikke bare finne nye proteiner og / eller protein modifikasjoner i deres uttrykk takket være sin kompatibilitet med massespektrometri deteksjon, men også en ny innsikt i markører validering. Dermed mini-2DE koblet til vestlige blotting tillatelser til å identifisere og validere innlegg-Translasjonell modifikasjoner, proteiner katabolisme og gir en kvalitativ sammenligning mellom ulike tilstander og / eller behandlinger. Heri, tilbyr vi en metode for å studere komponenter av protein aggregater funnet i AD og Lewy legeme demens som amyloid-beta peptid og alfa-synuclein. Vår fremgangsmåte kan således tilpasses for analyse av proteomet og uoppløselige proteiner ekstrakt fra humane hjernevevet og muse modeller også. Parallelt, kan det gi nyttig informasjon for studiet av molekylære og cellulære stier involvert i nevrodegenerative sykdommer så vel som potensielle nye biomarkører og terapeutisk mål.

Proteomikk på hjernevev forblir utfordrende siden ingen ideell buffer eksisterer for å gjenopprette 100% av proteiner, spesielt membran-assosiert eller cytoskjelett proteiner. Det første sett av eksperimenter ble fokusert på leting etter en egnet lyseringsbuffer kompatible med de to fremgangsmåter og som gjør det mulig å gjenopprette et stort panel av protein. Således ble tre lysis buffere analysert for å bestemme den mest passende en. For det første ble det brukt den vanlige biokjemiske og molekylære biologi...

Watch this Scientific Journal Video about Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting at JoVE.c

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

En vanlig protein utvinning protokollen ved hjelp av urea / tiourinstoff / SDS buffer for mennesker og mus hjernevev tillater indentification av proteiner ved 2D-DIGE og deres påfølgende karakterisering av mini 2DE immunoblotting. Denne metoden gjør det mulig å oppnå mer reproduserbare og pålitelige resultater fra humane biopsier og eksperimentelle modeller.

Konsensus Brain-derived Protein, Utvinning Protokoll for studiet av menneskelige og Murint Brain Proteome Bruke Både 2D-DIGE og Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder for å studere nevrale morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation i Embryonic murin Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sekvensiell Foto bleking å avgrense Enkelt Schwann celler på nevromuskulær Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulering av Lillehjernen Granule Neuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em&gt; Å studere nevrale morfologi og migrasjon

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Høy oppløsning<em&gt; I Vivo</em&gt; Manuell Segmentering Protokoll for menneskelig hippocampus subfields Bruke 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell for å studere aksonal vekst mønstre og morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel ett-trinns Dissection Protokoll for Whole-mount Utarbeidelse av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

New Methods to Study Gustatory Coding

Nye metoder for å studere gustatorisk koding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Høy gjennomstrømming analyse av Locomotor atferd i Drosophila øya analysen

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolasjon og RNA utvinning av Neurons, makrofager og Microglia fra larver sebrafisk hjerner

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...