Name: lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis
Uploaded: 2014-07-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis at JoVE.com

Die mikroskopische Bildgebung wurde über die Dienste der Michigan State University Center for Advanced Microscopy durchgeführt. Mais Kallus wurde von der Mais Zentrum für Transformation der Iowa State University erworben. Die Autoren bedanken sich bei Jeffrey R. Weather der MSU Plant Research Laboratory für seine technische Unterstützung bei der Kohlenhydratanalyse danken. Diese Forschung wurde großzügig von der Mais-Marketing-Programm von Michigan (CMPM) und die Arbeitsgemeinschaft für Forschung Pflanzenbiotechnologie (CPBR) finanziert.

1. Vorbereitung der dsRNAi Konstrukte Wird für die Herunterregulierung von ZmCCR1 <ol><li> Design-Gen-spezifischen Primer einschließlich der erforderlichen Restriktionsenzym für die Herstellung einer dsRNAi Konstrukt zur Knock-out die ZmCCR1 Gen. Zwei Primer-Sets wurden entwickelt, um zwei Segmente Fragment ZmCCR1 cDNA verstärken:. Ein 523 bp-Fragment von Nukleotid 748 bis 1271 und ein 285 bp-Fragment von Nukleotid 986-1271 ZmCCR1 Die cDNA wurde von der Arizona Genome Institute ...

<ol>
	<li>Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin-ferulate+cross-links+in+grasses+-+Active+incorporation+of+ferulate+polysaccharide+esters+into+ryegrass+lignins.">Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins.</a> Carbohydrate research. , 275-178 (1995).</li><li>Park, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , (2011).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li><li>Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials.">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).</li><li>Dien, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+alfalfa+conversion+efficiencies+for+sugar+recovery+and+ethanol+production+by+altering+lignin+composition.">Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition.</a> Bioresource technology. , 102-6486 (2011).</li><li>Fu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Cinnamyl+Alcohol+Dehydrogenase+(CAD)+Leads+to+Improved+Saccharification+Efficiency+in+Switchgrass.">Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass.</a> Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).</li><li>Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-hydroxyphenyl,+guaiacyl,+and+syringyl+lignins+have+similar+inhibitory+effects+on+wall+degradability.">p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnology for biofuels. 3, (2010).</li><li>Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+for+deconstruction--poplar+trees+altered+in+cell+wall+lignification+improve+the+efficacy+of+bioethanol+production.">Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production.</a> The New phytologist. 194, 91-101 (2012).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, F., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+modification+improves+fermentable+sugar+yields+for+biofuel+production.">Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production.</a> Nature. 25, 759-761 (2007).</li><li>Ziebell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+4-coumaryl+alcohol+units+during+lignification+in+alfalfa+(Medicago+sativa)+alters+the+extractability+and+molecular+weight+of+lignin.">Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+alternatives+to+microbial+cellulase+mix+production:+corn+stover-produced+heterologous+multi-cellulases+readily+deconstruct+lignocellulosic+biomass+into+fermentable+sugars.">The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars.</a> Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).</li><li>Mol, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plant+gene+expression+by+antisense+RNA.">Regulation of plant gene expression by antisense RNA.</a> FEBS letters. 268, 427-430 (1990).</li><li>Adamo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+cosuppression+and+RNA+interference+enhance+germ-line+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans.">Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+silencing+by+intron-spliced+hairpin+RNAs.">Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.</a> Nature. 407, 319-320 (2000).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Maize+Cinnamoyl-Coenzyme+A+Reductase+via+RNA+Interference+Technology+Causes+Brown+Midrib+and+Improves+Ammonia+Fiber+Expansion-Pretreated+Conversion+into+Fermentable+Sugars+for+Biofuels.">Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels.</a> Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).</li><li>Altpeter, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+and+the+genetic+enhancement+of+crops:+myths+and+realities.">Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities.</a> Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).</li><li>Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+maize+cDNAs+encoding+cinnamoyl-CoA+reductase+(CCR)+and+differential+expression+of+the+corresponding+genes.">Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes.</a> Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).</li><li>Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference.">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).</li><li>Hatfield, R. D., Jung, H. -. J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+insoluble+residues+produced+by+the+Klason+lignin+and+acid+detergent+lignin+procedures.">A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures.</a> J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).</li><li>Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+structural+carbohydrates+and+lignin+in+biomass.">Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass.</a> Laboratory Analytic Procedure. , (2008).</li><li>Bate, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Relationship+between+Phenylalanine+Ammonia-Lyase+Levels+and+Phenylpropanoid+Accumulation+in+Transgenic+Tobacco+Identifies+a+Rate-Determining+Step+in+Natural+Product+Synthesis.">Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).</li><li>Hu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+lignin+biosynthesis+promotes+cellulose+accumulation+and+growth+in+transgenic+trees.">Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees.</a> Nature. 17, 808-812 (1999).</li><li>Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+cinnamyl+alcohol+dehydrogenase+deficiency+in+poplar+lignins.">Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins.</a> Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extracts+by+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.</a> The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

Die Zugänglichkeit mikrobieller Cellulasen Zellwandpolysacchariden Anlage ist weitgehend abhängig von dem Grad, in dem sie mit phenolischen Polymeren 23 verbunden. Die Umwandlungsrate aus Lignocellulose vergärbaren Zucker ist negativ mit Lignin-Gehalt in der Pflanzenzellwänden abgelagert secondadry korreliert. Dieser Zusammenhang wird auf die physikalischen Eigenschaften von Lignin, wie Hydrophobizität 24. chemischen Heterogenität zugeschrieben, und das Fehlen von regelmäßigen hydrolysierba...

Die Produktion von Biokraftstoffen aus Lignocellulose-Biomasse ist aufgrund seiner Fülle gegenwärtig in den USA ein sehr wünschenswert, und im Fall der nachhaltigen Ernte von land-und forstwirtschaftlichen Rest, die Fähigkeit, nicht direkt konkurrieren um Ackerflächen für Lebensmittel-und Futtermittelproduktion verwendet. Doch im Gegensatz zu Mais Getreide, das die Hauptquelle der derzeit in den USA erzeugt Biokraftstoff ist, sind Lignocellulose-Materialien deutlich komplexer und schwieriger zu brechen. Zusätzlich zu dem langkettigen Kohlenhydrate, Cellulose und Hemicellulose, die während der Fermentation von Lignocellulose-Materialien sind die Hauptquellen für Zucker sind, viele Arten von Pflanzenzellwänden Lignin enthalten, ein Polymer, das Phenylpropanoid Stärke, Abwehr gegen Pathogenbefall bietet, und Hydrophobie an der Wand der Zelle. Während für das Pflanzenwachstum und Überleben notwendig, Lignin stellt auch ein ernsthaftes Hindernis für die erfolgreiche enzymatische Umwandlung von Cellulose und hemicelluverlieren, um lösliche Zucker. Materialien mit hoher Lignin Inhalte sind in der Regel weniger wünschenswert Materialien sowohl für die Biokraftstoff (durch biologische Umwandlung Wege) und der Zellstoff-und Papierindustrie aufgrund der negativen Auswirkungen auf die Verarbeitungseigenschaften und Produktqualität. Daher könnte die genetische Manipulation von Pflanzenmaterialien für Lignin Reduzierung auf einem Niveau, das nicht mit Pflanzen strukturelle Stärke und Verteidigungssysteme nicht beeinträchtigt wichtig für die Senkung der Produktionskosten sowohl für die Lignocellulose Biokraftstoff und der Zellstoff-und Papier-Industrie werden. In Mais (Zea mays), Lignin kovalent vernetzt, um in der primären Zellwand und über ferulate Diferulat Brücken 2 Hemicellulose. Das Lignin-Hemicellulose Komplex bindet an Cellulosemikrofibrillen über Wasserstoffbrücken bilden eine komplexe Matrix, die Integrität und Stärke verleiht dem sekundären Zellwand. Die mechanische Festigkeit von Pflanzenzellwänden wird weitgehend durch die Art bestimmt lignin Untereinheiten 3-5. In früheren Studien, Veränderung der Anteile von Lignin-Untereinheiten hat keinen klaren Trend auf enzymatische Verdaulichkeit 6-11 gezeigt. Allerdings Senkungen in Ligningehalt zeigen in der Regel eine Verbesserung der Conversions 12,13 und kann ein Schlüssel zur Steigerung der Verdaulichkeit von Pflanzenmaterial durch hydrolytische Enzyme, einschließlich Endocellulasen, Cellobiohydrolasen und β-Glucosidasen 14 sein. Gentechnik, um die Expression von Transkripten zu regulieren wurde ausgiebig geübt, um Pflanzenmerkmale zu verbessern. Erweiterte Techniken, einschließlich Anti-Sense-15 und Co-Suppression 16 Technologien, ermöglichen eine effektive Down-Regulation von Zielgenen. Komplette Gen Knock-Out wurde auch mit Gen-Konstrukte Intron-RNA gespleißt Codierung mit einer Haarnadelstruktur 17 erreicht. Weiterhin ist ein Doppelstrang-RNA-Interferenz (dsRNAi)-Technik, dh ein leistungsfähiges und effektives Gen-Expression Mediator, die entweder gezielt Transkript Abbau oder Übersetzung Repression funktioniert, stellt ein starkes Mittel, um eine breite Palette von Unterdrückung Auswirkungen auf die Ziel-mRNA 18 induzieren. Gen-Silencing-Techniken zeigen mehrere Einschränkungen. Diese Techniken nicht genau regeln die Ebene der Transkription und es kann zu unerwarteten Silencing Auswirkungen auf andere homologe Gene verursachen. In diesem Verfahren beschäftigten wir Partikelbeschuss zu tragen dsRNAi die Konstrukte in das Maisgenom. Bis heute eine Vielzahl von Pflanzenarten wurden erfolgreich mit Partikelbeschuss, Agrobacterium vermittelte Transformation, Elektroporation und Mikroinjektion Verfahren transformiert. In Mais genetische Transformation ist die particle bombardment Methode gegenüber allen anderen Methoden vorteilhaft, weil es die effizienteste. Partikelbeschuss ist nicht abhängig von Bakterien, so daß das Verfahren frei von biologischen Einschränkungen wie der Größe des Gens oder Gen-Artenigin oder die Pflanze Genotyp. Die physikalische Transgen Abgabesystem ermöglicht hochmolekularen DNA und mehreren Genen in Pflanzengenomen und in bestimmten Fällen in Chloroplasten mit hoher Transformationseffizienz 19 eingeführt werden. Das Lignin Verringerung des Gefäßsystems der Blattmittelrippe über Rasterelektronenmikroskopie (SEM) dargestellt werden, die nützlich für die Untersuchung der Topographie und der Zusammensetzung der Proben ist. In Maispflanzen, zwei der Cinnamoyl-CoA-Reduktase (ZmCCR1: X98083 und ZmCCR2: Y15069)-Gene wurden in das Maisgenom 20 gefunden. Cinnamoyl-CoA-Reduktase katalysiert die Umwandlung der Hydroxycinnamoyl-CoA-Ester in Cinnamyl Aldehyden. Wir wählten die ZmCCR1 Gens herunterregulieren, weil dieses Enzym das Gen in allen Geweben exprimiert verholzenden. Die 523 Nukleotide am 3&#39;-Terminus des Gens wurden ZmCCR1 für eine dsRNAi Konstrukt gewählt, weil die Sequenzen zu sein schienvielfältiger als im Vergleich zu denen von ZmCCR2. So würde das Konstrukt genau dsRNAi nur ZmCCR1 binden, Vermeidung von Off-Target-Silencing-21. Ein ZmCCR1_RNAi Konstrukt wurde in der zytoplasmatischen Expressionssystems ImpactVector1.1-Tag konstruiert (IV 1,1), enthaltend das grüne Gewebe spezifischen Promotor, Ribulose-1 ,5-bisphosphat-Carboxylase-Oxygenase (RuBisCO). Um die Auswirkungen der dsRNAi bauen auf transgene Pflanzen zu untersuchen, wurde das Lignin-Gehalt quantifiziert. Die Klason (säureunlösliche) Lignin Messung ist bekannt, genauer im Vergleich zu der sauren Detergens-Lignin Quantifizierungsverfahren, die ein Teil des Lignins 22 zu lösen. Daher wurde die Klason Lignin in transgenen Maisstengel gemessen. Dieses Verfahren besteht aus zwei Schritten, die saure Hydrolyse in lösliche polymere Kohlenhydrate Monosaccharide 23 umwandelt. Das hydrolysierte Biomasse wurde dann in Säure löslichen und unlöslichen Materialien fraktioniertALS und die Säure unlösliche Lignin wurde nach früheren Studien 23,24 gemessen. Idealerweise sollte Lignin Analyse Extraktionen mit Wasser und Ethanol vor der Hydrolyse, um lösliche Materialien, die mit dem Ergebnis stören können, und eine post-Hydrolyse Verbrennung des Lignin-Rest, für jede in dem Rückstand enthalten Asche ausmachen. Ohne diese Maßnahmen konnte die Lignin-Gehalt der Probe künstlich aufgebläht werden. Der vollständige Verfahren wird hier dargestellt, aber für unsere Versuche waren wir nicht in der Lage, diese beiden Schritte aufgrund der geringen Materialvolumens zum Testen durch Zwei weitere Zellwandbestandteile, Cellulose und Hemicellulose wurden auch in der Lignin herunterreguliert transgenen Maislinien analysiert. Es wurde berichtet, dass transgene Pflanzen, die entweder in ihrer Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL) 25, 4-Coumarat herunterreguliert sind: CoA-Ligase (4CL) 26, ein oder Zimtalkohollcohol-Dehydrogenase (CAD) 27 zeigen einen Anstieg in anderen Zellwandstrukturkomponenten. Als ersten Schritt in unseren Studien wurde kristalline Cellulose nach dem Verfahren Updegraff 28 gemessen. Diese Methode wurde ursprünglich zur Bestimmung von Cellulose in einer großen Anzahl von cellulolytischen Bakterien und Pilze entwickelt. Kurz gesagt, wurden die gemahlenen Mais Aktien mit Updegraff Reagenz (: Salpetersäure: Essigsäure Wasser) behandelt, um Hemicellulose, Lignin und xylosans entfernen. Die kristalline Cellulose wurde vollständig durch Zugabe von H 2 SO 4 in Glucose über Saeman hydrolysiert. Die kristalline Cellulose wurde dann unter Verwendung der farbmetrischen Verfahren Anthron 29 untersucht. Um zu überprüfen, ob die Hemicellulose Inhalt geändert wurden, wurden die Extrakte aus Monosaccharid gemahlen Stiele mit Trifluoressigsäure hydrolysiert, derivatisiert mit dem Alditolacetat Verfahren und durch Gaschromatographie (GC) 30 analysiert dann. Die detaillierten Verfahren für kristalline celCellulose und den Matrixzusammensetzung Polysaccharide Analysen sind in Foster et al. (2010) 31. Hier beschreiben wir die für Lignin verwendeten Verfahren Herunterregulierung in Mais über eine RNAi-Technologie, Partikelbeschuss Transformation und Lignin-Analyse für beschleunigte Dekonstruktion von Mais Lignocellulose in vergärbaren Zucker für Biokraftstoffe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

Um die Verwendung von Lignocellulose-Biomasse als Alternative Bioenergie Ressource, bei der biologischen Umsetzungsprozesse zu erleichtern, ist eine Vorbehandlung erforderlich Schritt zu öffnen, die Struktur der Pflanzenzellwand, die Erhöhung der Zugänglichkeit der Zellwand Kohlenhydraten. Lignin, ein Polyphenol Material in vielen Zelltypen vorhanden Wand, ist bekannt, dass eine erhebliche Behinderung der Zugang Enzym sein. Reduzierung der Ligningehalt auf ein Niveau, das nicht mit der strukturellen Integrität und Verteidigungssystem der Anlage nicht stört könnte ein wertvoller Schritt, um die Kosten der Bioethanolproduktion zu reduzieren. In dieser Studie haben wir genetisch herunterreguliert einem der Lignin-Biosynthese-Genen, Cinnamoyl-CoA-Reduktase (ZmCCR1) über ein Doppelstrang-RNA-Interferenztechnik. Die ZmCCR1_RNAi Konstrukt wurde mit der Partikelbeschuss Verfahren in die Maisgenom integriert. Transgene Maispflanzen wuchsen in der Regel im Vergleich zu den Kontrollpflanzen Wildtyp ohne interfering mit Biomasse Wachstum oder Abwehrmechanismen, mit Ausnahme der Anzeige der Braunfärbung in transgenen Pflanzen Blattmittelrippen, Hülsen, und Stängel. Die mikroskopische Analysen in Verbindung mit der histologischen Test ergab, dass die Blatt Sklerenchymfasern wurden verdünnt, aber die Struktur und Größe der anderen Hauptgefäßsystemkomponenten nicht verändert wurde. Der Ligningehalt in der transgenen Mais wurde von 7-8,7% verringert wurde das kristalline Cellulosegehalt in Reaktion auf Lignin Reduktion erhöht und Hemicellulosen unverändert. Die Analysen können zeigen, dass der Kohlenstofffluss kann von Lignin-Biosynthese Cellulose-Biosynthese verschoben wurden. Dieser Artikel umreißt die zur Herunterregulierung der Ligningehalt in Mais via RNAi-Technik Verfahren und die Zellwandzusammensetzungsanalyse verwendet, um die Wirkung der Modifikationen auf der Zellwandstruktur zu überprüfen.

Wir haben eine Verringerung der Ligningehalt in Maispflanzen durch RNAi gezeigt. Die Partikelbeschuss-Transformationsverfahren ergab rund 30% trnasformation Effizienz. Die Gen-Silencing von ZmCCR1 wurde konsequent in T0-T2 Generationen beobachtet. Die Lignin reduziert transgenics wuchs ähnlich wie Wildtyp-Mais-Pflanzen, außer für die Anzeige von Braunfärbung in der Blattmittelrippe, Schale und Schaft. Die histologischen Test hat gezeigt, dass die Mutantenlinien zeigen eine signifikante Reduktion der Zellwan...

Watch this Scientific Journal Video about Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis at JoVE.com

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Herunterregulierung<em&gt; Zea mays</em&gt; Über dsRNAi und Klason Lignin Analyse

Ein Doppelstrang-RNA-Interferenz (dsRNAi)-Technik wird eingesetzt, um nach unten zu regulieren den Mais Cinnamoyl Coenzym A-Reduktase (ZmCCR1)-Gen zu niedrigeren Pflanzen Ligningehalt. Lignin Down-Regulation aus der Zellwand wird durch mikroskopische Analysen visualisiert und durch die Klason Verfahren quantifiziert. Änderungen der Zusammensetzung in kristalliner Cellulose und Hemicellulose werden analysiert.

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Forschung

Biotechnik

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

Studieren weicher Materie und biologischer Systeme über eine Breite Länge-Skala von Nanometer- und Mikrometer Größen im Kleinwinkel Neutronendiffraktometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Schnelle, skalierbare Montage und Beladung von bioaktiven Proteinen und Immunstimulantien in diversen synthetischen darin über Flash-Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Entwicklung antiviraler Wirkstoffe mittels Oberflächenplasmonenresonanz

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...