Name: lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis
Uploaded: 2014-07-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis at JoVE.com

ההדמיה המיקרוסקופית נערכה באמצעות השירותים של מרכז אוניברסיטת מישיגן למתקדם מיקרוסקופית. יבלת תירס נרכשה ממרכז טרנספורמציה תירס של אוניברסיטת איווה סטייט. המחברים מבקשים להודות לר &#39;ג&#39;פרי Weatherhead של מעבדת מחקר צמח MSU לקבלת הסיוע הטכני שלו על הניתוח של הפחמימות. מחקר זה מומן בנדיבות על ידי תכנית תירס השיווק של מישיגן (CMPM) וConsortium למחקר ביוטכנולוגיה צמח (CPBR).

1. הכנה של מבני dsRNAi משמש לDown-תקנה של ZmCCR1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים ספציפיים גן העיצוב כוללים אתרי אנזים הגבלה הכרחיים להכנת dsRNAi לבנות לעקום החוצה את גן ZmCCR1. שתי קבוצות פריימר נועדו להגביר שני מגזרים שבר של ZmCCR1 cDNA:. בר 523 נ&qu...

<ol>
	<li>Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin-ferulate+cross-links+in+grasses+-+Active+incorporation+of+ferulate+polysaccharide+esters+into+ryegrass+lignins.">Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins.</a> Carbohydrate research. , 275-178 (1995).</li><li>Park, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , (2011).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li><li>Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials.">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).</li><li>Dien, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+alfalfa+conversion+efficiencies+for+sugar+recovery+and+ethanol+production+by+altering+lignin+composition.">Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition.</a> Bioresource technology. , 102-6486 (2011).</li><li>Fu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Cinnamyl+Alcohol+Dehydrogenase+(CAD)+Leads+to+Improved+Saccharification+Efficiency+in+Switchgrass.">Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass.</a> Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).</li><li>Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-hydroxyphenyl,+guaiacyl,+and+syringyl+lignins+have+similar+inhibitory+effects+on+wall+degradability.">p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnology for biofuels. 3, (2010).</li><li>Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+for+deconstruction--poplar+trees+altered+in+cell+wall+lignification+improve+the+efficacy+of+bioethanol+production.">Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production.</a> The New phytologist. 194, 91-101 (2012).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, F., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+modification+improves+fermentable+sugar+yields+for+biofuel+production.">Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production.</a> Nature. 25, 759-761 (2007).</li><li>Ziebell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+4-coumaryl+alcohol+units+during+lignification+in+alfalfa+(Medicago+sativa)+alters+the+extractability+and+molecular+weight+of+lignin.">Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+alternatives+to+microbial+cellulase+mix+production:+corn+stover-produced+heterologous+multi-cellulases+readily+deconstruct+lignocellulosic+biomass+into+fermentable+sugars.">The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars.</a> Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).</li><li>Mol, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plant+gene+expression+by+antisense+RNA.">Regulation of plant gene expression by antisense RNA.</a> FEBS letters. 268, 427-430 (1990).</li><li>Adamo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+cosuppression+and+RNA+interference+enhance+germ-line+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans.">Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+silencing+by+intron-spliced+hairpin+RNAs.">Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.</a> Nature. 407, 319-320 (2000).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Maize+Cinnamoyl-Coenzyme+A+Reductase+via+RNA+Interference+Technology+Causes+Brown+Midrib+and+Improves+Ammonia+Fiber+Expansion-Pretreated+Conversion+into+Fermentable+Sugars+for+Biofuels.">Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels.</a> Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).</li><li>Altpeter, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+and+the+genetic+enhancement+of+crops:+myths+and+realities.">Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities.</a> Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).</li><li>Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+maize+cDNAs+encoding+cinnamoyl-CoA+reductase+(CCR)+and+differential+expression+of+the+corresponding+genes.">Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes.</a> Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).</li><li>Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference.">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).</li><li>Hatfield, R. D., Jung, H. -. J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+insoluble+residues+produced+by+the+Klason+lignin+and+acid+detergent+lignin+procedures.">A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures.</a> J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).</li><li>Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+structural+carbohydrates+and+lignin+in+biomass.">Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass.</a> Laboratory Analytic Procedure. , (2008).</li><li>Bate, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Relationship+between+Phenylalanine+Ammonia-Lyase+Levels+and+Phenylpropanoid+Accumulation+in+Transgenic+Tobacco+Identifies+a+Rate-Determining+Step+in+Natural+Product+Synthesis.">Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).</li><li>Hu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+lignin+biosynthesis+promotes+cellulose+accumulation+and+growth+in+transgenic+trees.">Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees.</a> Nature. 17, 808-812 (1999).</li><li>Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+cinnamyl+alcohol+dehydrogenase+deficiency+in+poplar+lignins.">Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins.</a> Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extracts+by+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.</a> The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

הנגישות של cellulases חיידקים לשתול דופן תא סוכרים תלויה במידה רבה על המידה שבה הם קשורים עם פולימרים פנוליות 23. יחס ההמרה מביומסה lignocellulosic לתסיס סוכר מתואם שלילי עם תוכן ליגנין הופקד בקירות תא secondadry צמח. קשר זה מיוחס למאפיינים הפיזיים של ליגנין כגון הידרופוביות 2...

הייצור של דלק ביולוגי מביומסה lignocellulosic רצוי מאוד בשל השפע הנוכחי שלה בארה&quot;ב 1, ובמקרה של קציר קיימא של שאריות חקלאיות וייעור, את היכולת לא להתחרות ישירות לשדה יבול המשמש לייצור מזון למזון ובעלי חיים. עם זאת, בניגוד לגרעיני תירס, המהווה את המקור העיקרי של דלק ביולוגי שנוצר כיום בארה&quot;ב, חומרי lignocellulosic באופן משמעותי יותר מורכב וקשה לשבור. בנוסף לפחמימות ארוכת שרשרת, תאית hemicellulose, שהם המקורות העיקריים של סוכרים במהלך התסיסה של חומרי lignocellulosic, סוגים רבים של קירות תא הצמח מכילים גם ליגנין, פולימר phenylpropanoid המספק כוח, הגנה מפני התקפת הפתוגן, והידרופוביות לקירות תא. אמנם הכרחי לגידול צמחים והישרדות, ליגנין גם מציג מכשול משמעותי להמרה האנזימטית המוצלחת של התאית וhemicelluלהפסיד לסוכרים מסיסים. חומרים בעלי תוכן ליגנין גבוה הם בדרך כלל חומרים פחות רצויים עבור שני הדלק הביולוגי (דרך מסלולי גיור ביולוגי) ותעשיות עיסת נייר בשל ההשפעות השליליות על מאפייני עיבוד ואיכות מוצר. לפיכך, מניפולציה גנטית של חומרים צמחיים ליגנין הפחתה ברמה שלא תפריע לכוח מבני יבול ומערכות הגנה עשויה להיות חשובה לצמצום עלויות ייצור עבור שני הדלק הביולוגי lignocellulosic ותעשיות עיסת נייר. בתירס (Zea mays), ליגנין הוא קוולנטית צולבים לhemicellulose בקיר התא הראשוני באמצעות ferulate וגשרי diferulate 2. מורכב ליגנין-hemicellulose נקשר microfibrils תאית באמצעות קשרי מימן, ויוצר מטריצה ​​מורכבת שמעניקה שלמות וכוח לקיר התא המשני. החוזק המכני של קירות תא הצמח נקבע במידה רבה על ידי הסוג של lignin יחידות משנה 3-5. במחקרים קודמים, לשנות את הפרופורציות של יחידות משנה ליגנין לא הראה מגמה ברורה בעיכול אנזימטי 6-11. עם זאת, ירידות בתוכן ליגנין בדרך כלל מראות שיפור בהמרות 12,13 ועשוי להיות מפתח להגדלת הנעכלות של חומר צמחי על ידי אנזימי hydrolytic כולל endocellulases, cellobiohydrolases, וβ-glucosidases 14. הנדסה גנטית כדי לווסת את רמת הביטוי של תעתיקים כבר התאמנה באופן נרחב כדי לשפר את יבול תכונות. טכניקות מתקדמות, ובכלל זה נגד תחושה 15 ושיתוף דיכוי 16 טכנולוגיות, מאפשרות יעילות למטה רגולציה של גנים המטרה. עקום החוצה גן שלם גם הושג באמצעות בונה גן מקודד RNA-שחבור אינטרון עם מבנה סיכת ראש 17. יתר על כן, התערבות RNA פעמיים תקועה טכניקה (dsRNAi), כלומר תקשורת ביטוי גנים חזקה ויעילהטור שעובד או על ידי השפלת תמליל מיקוד או דיכוי תרגום, מספק אמצעים חזקים כדי לגרום למגוון רחב של תופעות דיכוי על היעד mRNA 18. טכניקות השתקת גנים להראות כמה מגבלות. טכניקות אלו דווקא לא לווסת את הרמה של שעתוק וזה יכול לגרום לתופעות בלתי צפויות בהשתקת גנים הומולוגיים אחרים. בשיטה זו, אנו מועסקים הפצצת חלקיקים לבצע dsRNAi בונה לתוך הגנום התירס. נכון להיום, מגוון רחב של מיני צמחים כבר שינה בהצלחה באמצעות הפצצת חלקיקים, שינוי בתיווך Agrobacterium, electroporation, ושיטות microinjection. בשינוי גנטי תירס, שיטת הפצצת חלקיקים יש יתרון על פני כל השיטות האחרות, מכיוון שהוא יעיל ביותר. הפצצת חלקיקים אינה תלויה בחיידקים, ולכן השיטה היא ללא אילוצים ביולוגיים כגון הגודל של הגן, מינים של גן אוigin, או גנוטיפ הצמח. מערכת מסירת transgene הפיסית מאפשרת DNA משקל מולקולרי גבוה ומספר רבים של גנים כדי להיות הציגה לתוך הגנום של צמח, ובמקרים מסוימים לכלורופלסטים ביעילות שינוי גבוה 19. הפחתת ליגנין במערכת כלי הדם של אמצע צלע העלים ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) אשר מועילה לבחינת הטופוגרפיה ואת ההרכב של דגימות. בצמחי תירס, שתיים מרדוקטאז cinnamoyl-CoA (ZmCCR1: X98083 וZmCCR2: Y15069) גנים נמצאו בגנום התירס 20. רדוקטאז Cinnamoyl-CoA מזרז את ההמרה של אסטרים hydroxycinnamoyl-CoA לאלדהידים cinnamyl. אנחנו בחרנו בגן ZmCCR1 ללמטה לווסת אנזים זה, כי הגן מתבטא בכל רקמות lignifying. 523 נוקלאוטידים בתחנה הסופית של &#39;3 של גן ZmCCR1 נבחרו לdsRNAi לבנות כי הרצפים שנראהמגוון יותר בהשוואה לאלו של ZmCCR2. לפיכך, מבנה dsRNAi הייתי דווקא להיקשר רק לZmCCR1, הימנעות מחוץ יעד השתקת 21. מבנה ZmCCR1_RNAi תוכנן לImpactVector1.1 תג מערכת ביטוי cytoplasmic (IV 1.1) המכיל את אמרגן הרקמות הספציפי הירוק, ribulose-1, oxygenase 5-bisphosphate carboxylase (RuBisCO). כדי לחקור את ההשפעות של dsRNAi לבנות על צמחים מהונדסים, תוכן ליגנין היה לכמת. המדידה ליגנין Klason (חומצה לא מסיס) ידועה להיות מדויקים יותר בהשוואה לשיטות הכימות ליגנין חומר ניקוי החומצה שsolubilize כמה ליגנין 22. לכן, ליגנין Klason נמדד בגבעולי תירס מהונדסים. הליך זה מורכב מחומצת הידרוליזה שני שלבים שממירה פחמימות פולימריים למונוסכרידים מסיס 23. ביומסה שעברה הידרוליזה הייתה אז מופרדת לmateri מסיסה ובלתי מסיסה החומצהals וליגנין מסיס החומצה נמדדו על פי מחקרים קודמים 23,24. באופן אידיאלי, ניתוח ליגנין צריך לכלול עקירות עם מים ואתנול לפני צעד הידרוליזה, על מנת להסיר חומרים מסיסים שיכול להטות את התוצאות, ובעירה שלאחר הידרוליזה של שאריות ליגנין לתת דין וחשבון לכל אפר נוכח בשאריות. ללא צעדים אלה, תוכן ליגנין של המדגם יכול להיות מנופח באופן מלאכותי. השיטה המלאה מוצגת כאן, עם זאת לניסויים שלנו לא הצליחו לבצע את שני הצעדים האלה בשל ההיקף הקטן של חומר זמין לבדיקות שני מרכיבים אחרים של דופן תא, תאית hemicellulose נותחו גם בליגנין קווי תירס מהונדס למטה מוסדר. זה כבר דווח כי צמחים מהונדסים שהיו למטה מוסדר באו אמונית האנזים זה פנילאלנין (PAL) 25, 4 coumarate-: האנזים CoA (4CL) 26, או cinnamylדהידרוגנז lcohol (CAD) 27 להראות עלייה ברכיבים מבניים דופן תא אחרים. כצעד ראשון במחקרים שלנו, תאית גבישים נמדד תוך שימוש בשיטת Updegraff 28. שיטה זו תוכננה במקור לקביעת תאית במספר רב של חיידקים ופטריות cellulolytic. בקצרה, טופלו מניות התירס הסתובבו עם מגיב Updegraff (חומצה אצטית: חומצה חנקתית: מים) כדי להסיר hemicellulose, ליגנין, וxylosans. תאית גבישים הייתה הידרוליזה לחלוטין לגלוקוז באמצעות הידרוליזה Saeman על ידי הוספת H 2 SO 4. תאית גבישים הייתה אז assayed בשיטת anthrone colorimetric 29. כדי לוודא אם תוכן hemicellulose שונו, תמציות monosaccharide מגבעולים הסתובבו היו הידרוליזה באמצעות חומצת trifluoroacetic, derivatized בשיטה אצטט alditol ולאחר מכן נותחו על ידי גז כרומטוגרפיה (GC) 30. הנהלים מפורטים עבור טלפונים סלולר גבישיםניתוחי הרכב סוכרים תוכן ומטריצת lulose מתוארים בפוסטר et al. (2010) ביום 31. כאן, אנו מתארים את הנהלים המשמשים ליגנין למטה רגולציה בתירס באמצעות טכנולוגיית RNAi, שינוי הפצצת חלקיקים, וניתוח ליגנין לפירוק מואץ של ביומסה lignocellulosic תירס לסוכרים תסיס לדלק ביולוגי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

כדי להקל על השימוש בביומסה lignocellulosic כמשאב יואנרגיה חלופי, במהלך תהליכי גיור ביולוגיים, יש צורך בצעד מקדים לפתוח את המבנה של דופן תא צמח, הגדלת הנגישות של דופן תא הפחמימות. ליגנין, חומרי polyphenolic נוכח סוגים רבים דופן תא, ידוע להיות מכשול משמעותי לאנזים גישה. ירידה בתוכן יגנין לרמה שאינו מפריעה למערכת יושרה והגנה המבנית של הצמח עשויה להיות צעד חשוב כדי להפחית את עלויות ייצור bioethanol. במחקר זה, יש לנו למטה מוסדר מבחינה גנטית אחד מהגנים הקשורים לביוסינתזה ליגנין, רדוקטאז cinnamoyl-CoA (ZmCCR1) באמצעות טכניקת התערבות גדילים כפולה RNA. מבנה ZmCCR1_RNAi שולב בגנום התירס בשיטת הפצצת חלקיקים. צמחי תירס מהונדסים גדלו בדרך כלל בהשוואה לצמחי ביקורת הפראית מהסוג ללא בterfering עם צמיחה ביומסה או מנגנוני הגנה, הפרט להצגה של חום צבע באמצע צלעות מהונדסות עלה צמחים, קליפות, וגבעולים. הניתוחים המיקרוסקופיים, בשיתוף עם assay היסטולוגית, גילו כי סיבי sclerenchyma העלה היו דלילים אך המבנה והגודל של רכיבי מערכת כלי דם גדולים אחרים לא שונו. תוכן ליגנין בתירס המהונדס הופחת ב 7-8.7%, התוכן תאית גבישים הוגדל בתגובה להפחתת ליגנין, וhemicelluloses נותר ללא שינוי. הניתוחים עשויים להצביע על כך זרימת פחמן שאולי הייתה זזה מביוסינתזה יגנין לביוסינתזה תאית. מאמר זה מפרט את הנהלים המשמשים ללמטה להסדיר את תוכן ליגנין בתירס באמצעות טכנולוגיית RNAi, ואת דופן תא ההלחנה ניתוחים משמש לאימות את ההשפעה של השינויים בתא קיר המבנה.

אנחנו הוכיחו הפחתה בתוכן יגנין בצמחי תירס באמצעות RNAi. שיטת שינוי הפצצת החלקיקים הניבה סביב 30% יעילות trnasformation. השתקת הגן של ZmCCR1 נצפתה באופן עקבי בדורות T0-T2. Transgenics ליגנין המופחת גדל באופן דומה לצמחי תירס wildtype פרט להצגת גוון חום באמצע עלה צלעות, הקליפה והגזע. Assay היס?...

Watch this Scientific Journal Video about Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis at JoVE.com

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

ליגנין Down-תקנה של<em&gt; Zea mays</em&gt; באמצעות dsRNAi וKlason ליגנין ניתוח

טכניקת התערבות RNA פעמיים תקועה (dsRNAi) היא מועסק ללמטה להסדיר את אנזים cinnamoyl תירס רדוקטאז גן (ZmCCR1) לתוכן ליגנין צמח נמוך יותר. ליגנין למטה תקנה מקיר התא דמיינו ידי ניתוח מיקרוסקופי ולכמת בשיטת Klason. שינויי הלחנה בhemicellulose ותאיים גבישים מנותחים.

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

לימוד-משנה רך מערכות ביולוגיות על פני אורך בקנה מידה רחבה מן ננומטר ו מיקרומטר גדלים בזווית-הקטנה ניוטרון diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

בתרבית של חלוקת התא במטריצות תלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונאפוקלית כמותיים

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

הרכבה מהירה, מדרגי וטעינה של חלבונים ביו, Immunostimulants לתוך Nanocarriers סינתטי מגוונות באמצעות פלאש Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

התקני שדה חשמליים ומגנטיים לגירוי רקמות ביולוגיות

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

הנדסת חומרים אנטי-ויראליים באמצעות תהודה פלסמונית על פני השטח

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...