Name: lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis
Uploaded: 2014-07-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis at JoVE.com

Den mikroskopiske bildebehandling ble gjennomført via tjenestene til Michigan State University Center for Advanced Mikros. Mais callus ble kjøpt fra Mais Transformation Center of Iowa State University. Forfatterne ønsker å takke Jeffrey R. Weather av MSU Plant Research Laboratory for sin teknisk assistanse på karbohydrat analyse. Denne forskningen ble sjenerøst finansiert av Corn Marketing Program of Michigan (CMPM) og Consortium for Plant Biotechnology forskning (CPBR).

En. Utarbeidelse av dsRNAi konstruerer brukt for nedregulering av ZmCCR1 <ol><li> Design genet spesifikke primere inkludert nødvendige restriksjonsenzym nettsteder for å lage en dsRNAi konstruere til knock-out på ZmCCR1 genet. To primer settene ble designet for å forsterke to fragment segmenter av ZmCCR1 cDNA:. En 523 bp fragment fra nukleotid 748-1271, og en 285 bp fragment fra nukleotid 986-1271 The ZmCCR1 cDNA ble levert fra Arizona Genome Institute (AGI). Ytterligere detalje...

<ol>
	<li>Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin-ferulate+cross-links+in+grasses+-+Active+incorporation+of+ferulate+polysaccharide+esters+into+ryegrass+lignins.">Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins.</a> Carbohydrate research. , 275-178 (1995).</li><li>Park, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , (2011).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li><li>Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials.">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).</li><li>Dien, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+alfalfa+conversion+efficiencies+for+sugar+recovery+and+ethanol+production+by+altering+lignin+composition.">Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition.</a> Bioresource technology. , 102-6486 (2011).</li><li>Fu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Cinnamyl+Alcohol+Dehydrogenase+(CAD)+Leads+to+Improved+Saccharification+Efficiency+in+Switchgrass.">Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass.</a> Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).</li><li>Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-hydroxyphenyl,+guaiacyl,+and+syringyl+lignins+have+similar+inhibitory+effects+on+wall+degradability.">p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnology for biofuels. 3, (2010).</li><li>Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+for+deconstruction--poplar+trees+altered+in+cell+wall+lignification+improve+the+efficacy+of+bioethanol+production.">Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production.</a> The New phytologist. 194, 91-101 (2012).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, F., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+modification+improves+fermentable+sugar+yields+for+biofuel+production.">Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production.</a> Nature. 25, 759-761 (2007).</li><li>Ziebell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+4-coumaryl+alcohol+units+during+lignification+in+alfalfa+(Medicago+sativa)+alters+the+extractability+and+molecular+weight+of+lignin.">Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+alternatives+to+microbial+cellulase+mix+production:+corn+stover-produced+heterologous+multi-cellulases+readily+deconstruct+lignocellulosic+biomass+into+fermentable+sugars.">The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars.</a> Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).</li><li>Mol, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plant+gene+expression+by+antisense+RNA.">Regulation of plant gene expression by antisense RNA.</a> FEBS letters. 268, 427-430 (1990).</li><li>Adamo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+cosuppression+and+RNA+interference+enhance+germ-line+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans.">Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+silencing+by+intron-spliced+hairpin+RNAs.">Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.</a> Nature. 407, 319-320 (2000).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Maize+Cinnamoyl-Coenzyme+A+Reductase+via+RNA+Interference+Technology+Causes+Brown+Midrib+and+Improves+Ammonia+Fiber+Expansion-Pretreated+Conversion+into+Fermentable+Sugars+for+Biofuels.">Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels.</a> Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).</li><li>Altpeter, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+and+the+genetic+enhancement+of+crops:+myths+and+realities.">Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities.</a> Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).</li><li>Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+maize+cDNAs+encoding+cinnamoyl-CoA+reductase+(CCR)+and+differential+expression+of+the+corresponding+genes.">Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes.</a> Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).</li><li>Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference.">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).</li><li>Hatfield, R. D., Jung, H. -. J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+insoluble+residues+produced+by+the+Klason+lignin+and+acid+detergent+lignin+procedures.">A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures.</a> J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).</li><li>Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+structural+carbohydrates+and+lignin+in+biomass.">Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass.</a> Laboratory Analytic Procedure. , (2008).</li><li>Bate, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Relationship+between+Phenylalanine+Ammonia-Lyase+Levels+and+Phenylpropanoid+Accumulation+in+Transgenic+Tobacco+Identifies+a+Rate-Determining+Step+in+Natural+Product+Synthesis.">Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).</li><li>Hu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+lignin+biosynthesis+promotes+cellulose+accumulation+and+growth+in+transgenic+trees.">Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees.</a> Nature. 17, 808-812 (1999).</li><li>Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+cinnamyl+alcohol+dehydrogenase+deficiency+in+poplar+lignins.">Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins.</a> Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extracts+by+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.</a> The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

Tilgjengeligheten av mikrobielle cellulaser å plante cellevegg polysakkarider er i stor grad avhengig av i hvilken grad de er forbundet med fenoliske polymerer 23. Konverteringskursen fra lignocellulose biomasse til gjæringsdyktig sukker er negativt korrelert med lignin innhold deponert i plante secondadry celleveggene. Denne korrelasjon er henført til de fysikalske egenskaper av lignin slik som hydrofobisitet 24, kjemisk heterogenitet, og fraværet av vanlig hydrolyserbar intermonomeric leddene...

I produksjon av biodrivstoff fra lignocelluloseholdig biomasse er meget ønskelig på grunn av den foreliggende mengde i US 1, og i tilfelle av en bærekraftig innhøstingen av rester jord-og skogbruk, evnen til å konkurrere direkte til dyrket mark anvendes for mat-og dyrefor-produksjon. Imidlertid, i motsetning til mais korn, som er hovedkilden for biodrivstoff tiden genereres i USA, lignocelluloseholdige materialer er betydelig mer komplisert og vanskelig å bryte ned. I tillegg til det langkjedede karbohydrater, cellulose og hemicellulose, som er de viktigste kilder til sukker ved gjæring av lignocelluloseholdige materialer, mange typer av plantecellevegger også inneholder lignin, et styrene polymer som gir styrke, forsvar mot patogene angrep, og hydrofobisitet til celleveggene. Mens nødvendige for plantevekst og overlevelse, lignin presenterer også en betydelig hindring for den vellykkede enzymatisk omdannelse av cellulose og hemicellutape mot løselige sukker. Materialer med høy lignin innholdet er generelt mindre ønskelig materialer for både biodrivstoff (gjennom biologisk konverterings pathways) og masse-og papirindustrien på grunn av de negative virkninger på prosesseringskarakteristika og produktkvalitet. Derfor kan genetisk manipulering av plantemateriale for lignin reduksjon på et nivå som ikke forstyrrer med crop strukturell styrke og forsvarssystemer være viktig for reduksjon av produksjonskostnader for både lignocellulose biobrensel og masse-og papirindustrien. I mais (Zea Mays), er lignin kovalent kryssbundet til hemicellulose i den primære celleveggen via ferulate og diferulate broer to. Det lignin-hemicellulose-komplekset bindes til cellulose mikrofibriller gjennom hydrogenbindinger, som danner et kompleks matrise som confers integritet og styrke til den sekundære celleveggen. Den mekaniske styrken av plantecellevegger er i stor grad bestemt av hvilken type lignin subenheter 3-5. I tidligere studier har endre proporsjonene av lignin subenheter vist noen klar trend på enzymatisk fordøyelighet 6-11. Men reduksjon i lignin-innhold generelt viser en forbedring i konverteringer 12,13 og kan være en nøkkel til å øke fordøyeligheten av plantemateriale av hydrolytiske enzymer, inkludert endocellulases, cellobiohydrolases og β-glucosidases 14. Genteknologi for å regulere uttrykket nivået av vitnemål har blitt grundig praktisert å forbedre avlingstrekk. Avanserte teknikker, inkludert anti-sense 15 og co-undertrykkelse 16 teknologier, muliggjøre effektiv nedregulering av målet gener. Komplett genet knock-out har også blitt oppnådd ved hjelp genet konstruerer koder intron-skjøtes RNA med en hårnål struktur 17. Videre, en dobbelttrådet RNA interferens (dsRNAi) teknikk, dvs. en kraftig og effektiv genuttrykk mediator som fungerer ved enten å målrette transkripsjon nedbrytning eller oversettelses undertrykkelse, gir en potent middel for å indusere en lang rekke undertrykkelse virkninger på mRNA-target 18.. Genet stanse teknikker viser flere begrensninger. Disse teknikkene ikke nøyaktig regulere nivået av transkripsjon og det kan føre til uventede Silencing effekter på andre homologe gener. I denne fremgangsmåten anvendes vi partikkel bombardement for å bære dsRNAi konstruerer inn i mais genom. Til dags dato har et stort utvalg av plantearter blitt forvandlet ved hjelp partikkel bombardement, Agrobacterium mediert transformasjon, elektroporering, og mikroinjeksjon metoder. I mais genetisk transformasjon, er partikkel-bombardement-metoden fordelaktig fremfor alle de andre metodene, fordi det er det mest effektive. Partikkel bombardement er ikke avhengig av bakterier, slik at metoden er fritt for biologiske begrensninger som for eksempel størrelsen av genet, arter av genet ellerigin eller planten genotype. Den fysiske transgenet leveringssystem muliggjør høy molekylvekt-DNA og multiple gener for å bli introdusert inn i plante genomer, og i visse tilfeller i kloroplaster med høy transformasjonseffektivitet 19.. Den lignin reduksjon i det vaskulære system av bladet midten av ribben kan visualiseres via scanning elektronmikroskopi (SEM) som er gunstig for behandlingen av topografi og sammensetningen av prøvene. I maisplanter, to av cinnamoylforbindelser-CoA-reduktase (ZmCCR1: X98083 og ZmCCR2: Y15069) gener ble funnet i maisgenomet 20. Cinnamoylforbindelser-CoA-reduktase katalyserer omdannelsen av hydroxycinnamoyl-CoA estere i cinnamyl aldehyder. Vi valgte ZmCCR1 genet for å ned-regulere dette enzymet, fordi genet blir uttrykt i alle lignifying vev. De 523 nukleotider ved 3&#39;-terminus av ZmCCR1-genet ble valgt ut for en dsRNAi konstruere fordi de sekvenser som syntes å væremer mangfoldig i forhold til de av ZmCCR2. Dermed vil den dsRNAi konstruere presist binde bare til ZmCCR1, unngå off-target stanse 21. En ZmCCR1_RNAi konstruere ble manipulert inn i cytoplasma uttrykk system ImpactVector1.1-tag (IV 1,1) som inneholder den grønne vev promoter, ribulose-bifosfatase-karboksylase/oksygenase-proteinet-1, 5-bisfosfat karboksylase oksygenase (Rubisco). For å studere effektene av den dsRNAi konstruere den transgene planter ble lignininnhold kvantifisert. Den Klason (syre-uløselig) lignin-måling er kjent for å være mer nøyaktig enn i de sure vaskemiddel lignin kvantifisering metoder som solubilisere noe av ligninet 22.. Derfor ble Klason lignin målt i transgene maisstengler. Denne fremgangsmåten består av en to-trinns syrehydrolyse som omdanner polymere karbohydrater til monosakkarider 23 oppløselige. Den hydrolysert biomasse ble deretter fraksjonert i syre løselig og uløselig materialerals og syren uløselig lignin ble målt i henhold til tidligere studier 23,24. Ideelt sett bør lignin-analyse omfatter ekstraksjoner med vann og etanol før hydrolyse-trinnet, for vannløselige materialer som kan påvirke resultatene for å fjerne, og en post-hydrolyse forbrenning av ligninet residuet å registrere eventuell aske som finnes i residuet. Uten disse trinn, kan lignin-innholdet i prøven økes kunstig. Den fullstendige fremgangsmåte er presentert her, men for våre eksperimenter var vi ute av stand til å utføre begge disse trinn på grunn av det lille volum av materiale som er tilgjengelig for testing To andre cellevegg komponenter, cellulose og hemicellulose ble også analysert i lignin nedregulert transgen maislinjer. Det har blitt rapportert at transgene planter som har blitt nedregulert i enten deres fenylalanin ammoniakk-lyase (PAL) 25, 4-coumarate: CoA ligase (4CL) 26, eller cinnamyl enlcohol dehydrogenase (CAD) 27 viser en økning i andre cellevegg-konstruksjonsdeler. Som et første skritt i våre studier, ble krystallinsk cellulose målt ved hjelp av Updegraff metode 28. Denne fremgangsmåten ble opprinnelig utviklet for bestemmelse av cellulose i et stort antall cellulolytic bakterier og sopp. Kort sagt ble de malte mais stocks behandlet med Updegraff reagens (eddiksyre: salpetersyre: vann) for å fjerne hemicellulose, lignin og xylosans. Den krystallinsk cellulose ble fullstendig hydrolysert til glukose via Saeman hydrolyse ved å legge H 2 SO 4. Det krystallinske cellulose ble deretter analysert ved hjelp av den kolorimetriske metoden anthrone 29.. For å kontrollere om den hemicellulose innholdet ble endret, ble monosakkarid ekstrakter fra malte stilker hydrolysert ved anvendelse av trifluoreddiksyre, derivatisert ved hjelp av alditol-acetat-metoden, og deretter analysert ved gasskromatografi (GC) 30. De detaljerte prosedyrer for krystallinsk cellose innhold og matrise polysakkarider sammensetning analyser er beskrevet i Foster et al. (2010) 31. Her beskriver vi de prosedyrer som brukes for lignin nedregulering i mais via en RNAi teknologi, partikkel bombardement transformasjon, og lignin analyse for akselerert dekonstruksjon av mais lignocellulose biomasse til gjæringsdyktig sukker for biodrivstoff.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

For å lette bruken av lignocelluloseholdig biomasse som et alternativ bioenergi ressurs, under biologiske omvandlingsprosesser, er en forbehandling trinn som trengs for å åpne opp strukturen av plantecelleveggen, noe som øker tilgjengeligheten av celleveggen karbohydrater. Lignin, en polyfenoliske materiale som finnes i mange cellevegg-typer, er kjent for å være en betydelig hindring for enzym tilgang. Reduksjon i lignin-innhold til et nivå som ikke forstyrrer den strukturelle integriteten og forsvarssystemet i anlegget kan være et verdifullt skritt for å redusere kostnadene ved produksjon av bioetanol. I denne studien, har vi genetisk nedregulert en av lignin-biosyntese-relaterte gener, cinnamoylforbindelser-CoA-reduktase (ZmCCR1) via en dobbelt-trådet RNA-interferens teknikk. Den ZmCCR1_RNAi konstrukt ble integrert i genomet ved hjelp av mais partikkel bombardement metoden. Transgene maisplanter vokste normalt i forhold til villtype kontrollanlegg uten iterfering med biomassevekst eller forsvarsmekanismer, med unntak av visning av brun-farge i transgene planter blad midten av ribbeina, skall og stilker. De mikroskopiske analyser, i forbindelse med den histologisk assay viste at blad sclerenchyma fibre ble tynnet men strukturen og størrelsen på andre viktige vaskulære system komponenter ble ikke forandret. Det lignin-innholdet i den transgene mais ble redusert med 7 til 8,7%, ble den krystallinske cellulose-innhold økes som reaksjon på lignin reduksjon, og hemicelluloser forble uendret. Analysene kan tyde på at karbonstrømmen kan ha blitt flyttet fra lignin biosyntese til cellulose biosyntese. Denne artikkelen delineates Fremgangsmåtene anvendt til å ned-regulere lignin-innholdet i mais via RNAi-teknologi, og celleveggen komposisjonelle analyser anvendes for å kontrollere effekten av endringer av celleveggstrukturen.

Vi har vist en reduksjon i lignin-innholdet i maisplanter via RNAi. Partikkel bombardement transformasjon metoden ga rundt 30% trnasformation effektivitet. Genet stanse av ZmCCR1 ble konsekvent observert i T0-T2 generasjoner. Lignin redusert transgenics vokste på samme måte som villtype maisplanter unntatt for visning brun farge i blad midten av ribben, skrelle, og stammen. Histologisk analyse har vist at de mutante linjer utviser en signifikant reduksjon i celleveggtykkelse av de sclerenchyma fibrene i mais ...

Watch this Scientific Journal Video about Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis at JoVE.com

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin nedregulering av<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi og Klason Lignin Analysis

En dobbelttrådet RNA interferens (dsRNAi) teknikken er ansatt for å ned-regulere mais cinnamoylforbindelser koenzym A-reduktase (ZmCCR1) genet til lavere plante lignin innhold. Lignin nedregulering av celleveggen blir visualisert ved mikroskopiske analyser og kvantifiseres ved Klason metoden. Sammensetningsendringer hemicellulose og krystallinsk cellulose blir analysert.

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Egenrapportering Stillaser for 3-dimensjonal Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifisering av Global diastolisk funksjon av Kinetisk modellering basert analyse av transmitral Flow via Parametrized diastolisk Fylling formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

Studerer Soft-materie og biologiske systemer over et bredt Lengde skala fra nanometer og mikrometer Størrelser på Small-vinkel Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Pattedyr celledeling i 3D matriser via kvantitative AC Confocal refleksjon mikroskopi

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Rask, skalerbar montering og lasting av bioaktive proteiner og Immunostimulants i ulike syntetisk Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Substructure Analyzer: En brukervennlig arbeidsflyt for rask utforskning og nøyaktig analyse av cellulære organer i fluorescensmikroskopibilder

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Elektriske og magnetiske feltenheter for stimulering av biologisk vev

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Tekniske antivirale midler via overflateplasmonresonans

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...