Name: quantification of breast cancer cell invasiveness using a three-dimensional (3d) model
Uploaded: 2014-06-11T13:00:00
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This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.

1. Cultura tridimensional de células de câncer de mama em Membrana Basal Matrix (A Técnica Embedment) <ol><li> Manuseio matriz membrana basal Matrigel: Descongele no gelo durante a noite a 4 ° C. Matriz da membrana basal é líquido a baixa temperatura mas solidifica à temperatura ambiente. Mantenha a matriz da membrana basal em gelo (Figuras 1A-B). </li><li> Cobrir a No.1 prato confocal com fundo de vidro com 50 ul de matriz da membrana basal por meio de difusão da matriz, utilizando a ponta de...

<ol>
	<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat Res. 752, 10-24 (2013).</li><li>Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+MCF-10A+acini.">The ultrastructure of MCF-10A acini.</a> J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).</li><li>Lelievre, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+phenotype+depends+on+reciprocal+interactions+between+the+extracellular+matrix+and+the+structural+organization+of+the+nucleus.">Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta4+integrin-dependent+formation+of+polarized+three-dimensional+architecture+confers+resistance+to+apoptosis+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium.</a> Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).</li><li>Cvetkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Induces+Invasiveness+of+Estrogen+Receptor-Negative+Human+Mammary+Epithelial+and+Breast+Cancer+Cells.">KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells.</a> Endocrinology. , 1999-2014 (2013).</li><li>Alemayehu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin2+regulates+lysophosphatidic+acid-induced+human+breast+tumor+cell+migration+and+invasion+via+Rap1+and+IQGAP1.">beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1.</a> PLoS One. , (2013).</li></ol>

O desenvolvimento das técnicas de cultura de células em 3D tem permitido aos investigadores estudar a transformação de células epiteliais da mama, o que nos permite visualizar as alterações morfológicas drásticas. Além de analisar a invasão da célula, os esferóides epiteliais mamárias simples ou multicelulares pode ser utilizado para avaliar alterações na adesão celular, a proliferação, tamanho, polaridade e basal-apical. Em contraste com os métodos previamente descritos, onde as células são cobert...

Migração e invasão de células individuais ou coletivas são duas características de câncer, e necessário para a propagação metastática de células de câncer 1-4. A capacidade de células cancerígenas para iniciar metástase depende da sua capacidade para migrar e invadem o tecido vizinho usando invadopodia para degradar a membrana basal das células. Invadopodia são saliências de degradação da matriz dinâmica ricas em actina que permitem a degradação da matriz extracelular através da liberação de proteases que degradam a matriz 5. Invasão de células do cancro envolve a degradação da matriz seguindo-se a migração das células cancerosas e isto é acompanhado de uma reorganização do ambiente da matriz tridimensional (3D) 2. Assim, para penetrar através da matriz, uma célula deve transformar a sua forma e interagir com a matriz extracelular (ECM) 2. A manutenção da integridade do tecido mamário depende fortemente controlled arquitectura dos tecidos, uma vez junções célula-ECM e de adesão célula-célula influenciar a expressão genética e a interrupção da polaridade epitelial pode levar ao aparecimento de cancro 6-10. No entanto, a maioria dos in vitro de migração e invasão ensaios como transwell ensaios de câmara ou ensaios ferida-risco são bidimensionais (2D) e, portanto, estes negligenciar as interações complexas entre as células e seu meio ambiente adjacente 3,6,8,11-14. Diversidades morfológicas e funcionais consideráveis, incluindo variações na morfologia celular, diferenciação celular, adesões célula-matriz e os padrões de expressão gênica foram detectados através da cultura de células em culturas 3D que são comumente faltando em 2D ensaia 2,6,8,11. Assim, a utilização de testes de 3D ​​são significativamente benéfico em recapitulando a mais fisiológica em condições in vivo, levando a uma melhor tradução das descobertas revolucionárias em pesquisa básica para a clínica 6-10. No entanto, deve-se notar, Apesar das muitas vantagens obtidas com a utilização de culturas em 3D, este modelo não pode capturar todas as complexidades do microambiente do tumor in vivo, que inclui vários tipos de células. No entanto, é possível incorporar células estromais em modelos 3D (por exemplo, os fibroblastos, leucócitos e macrófagos) para estudar o efeito da interação tumor-estroma na adesão célula cancerosa e invasão 15-17. Células epiteliais de mama em cultura crescer de forma mais eficaz quando as proteínas da MEC, como laminina e colágeno estão presentes. Com esta conhecida, uma mistura de matriz comercialmente disponível foi derivado de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) de tumor murino e é conhecido como matriz da membrana basal 2,8 Matrigel. Um número de técnicas têm sido estabelecido para cultivar células epiteliais como colónias em 3D da matriz da membrana basal 2,8. O modelo da matriz da membrana basal 3D é eficaz para o estabelecimento de células da mama, tanto malignas e não malignascrescimento, assemelhando-se o que está ocorrendo no ambiente in vivo 18,19. MCF10A células são células epiteliais mamarias não malignas. Quando crescido na matriz da membrana basal, estas células apresentam características de in vivo de células da mama normais e submetidos a proliferação celular, a polarização celular, apoptose e para estabelecer o espaço lúmen 8,12,20 controlada. Além disso, a aparência de núcleos de células de células que formam MCF10A ácinos em culturas 3D mais se assemelham aos de células epiteliais mamárias de tecido do que os cultivados em monocamada de 21. Estudos por Bissell e colegas foram os primeiros a mostrar que as células malignas da mama podem ser diferenciadas a partir de células não-malignas da mama, quando cultivada em um ambiente rico em laminina, uma vez que as células apresentam um fenótipo maligno altamente desorganizada, a proliferação aumentada, diminuída da célula-a- a adesão celular, o aumento da expressão de marcadores mesenquimais e um aumento no número de estrutura invasiva formado 3,6,22. Anormalidades do ambiente celular pode influenciar a formação do tumor 20. O método de cultura em 3D podem ser utilizados para estudar a eficácia de comunicação que ocorre entre as células tumorais e o seu ambiente envolvente e determinar a expressão de proteínas tais influências 14,20,21,23 comunicação. Este artigo estabelece uma metodologia detalhada para crescer MDA-MB-231 de cancro da mama em culturas em 3D para analisar invasão e para estudar a perda de morfologia epitelial utilizando um marcador epitelial laminina, um componente da membrana basal de células 18,19,24, 25. Os procedimentos detalhados fornecem a capacidade de quantificar com precisão e de forma reprodutível estreladas (invasiva) de formação da estrutura por qualquer célula de cancro invasivo e não se limitando a linhas celulares de cancro da mama (comum, tais como MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, ou T47D ). Assim, este ensaio pode servir como uma plataforma para avaliação da forma como a expressão da proteína em células ou tratamento com pro-ou anti-compostos invasivos regulam a degradação da matriz extracelular, pelas células únicas ou múltiplas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1062">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:265px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA10011-700</td>
			<td>Sterile, disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100-mm culture dish BD353003</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABD353003</td>
			<td>Sterile, disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL Falcon tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-918</td>
			<td>Sterile, disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL filtered tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-350</td>
			<td>Sterile, disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 uL filtered tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22234-016</td>
			<td>Sterile, disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 uL filtered tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22234-008</td>
			<td>Sterile, disposable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:265px;">MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Precooled before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB003.100</td>
			<td>Used at 3% for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A11029</td>
			<td>1:250 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A11011</td>
			<td>1:1200 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Anti-Beta-Catenin&#160;</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610153</td>
			<td>Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td>Used at 10% (v/v)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg&#8260;mL Solution in Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Used at 0.1% (1:10000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">InVivo Analyzer Suite&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kisspeptin-10 (KP-10)</td>
			<td style="width:265px;">EZ Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">PT0512100601</td>
			<td>Used at 100nM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Laminin&#160;</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>AB19012(CH)</td>
			<td>Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM-510 META laser scanning microscope&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used at 63X objective; oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel phenol red free (BD356237)</td>
			<td style="width:265px;">VWR</td>
			<td>CACB356237</td>
			<td>&#160;Lot No.2180819; 10.4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus IX-81 microscope&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic (added to media; used at 0.01%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mL pipet&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA53300-523</td>
			<td>Sterile, disposeable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 Medium with Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>Used for culturing of MDA-MB-231 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Used to trypsinize MDA-MB-231 cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)</td>
			<td style="width:265px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3150</td>
			<td>Used for culturing of MCF10A cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of breast cancer cell invasiveness using a three-dimensional (3d) model

É agora bem conhecido que o microambiente celular e do tecido são reguladores críticos que influenciam a iniciação e progressão tumoral. Além disso, a matriz extracelular (ECM) tem sido demonstrado ser um regulador crítico do comportamento das células em cultura e na homeostase in vivo. A abordagem actual de cultura de células em duas dimensões (2D), superfícies de plástico resulta na perturbação e perda de interacções complexas entre as células e o seu microambiente. Através do uso de três dimensões (3D) de ensaios de cultura, são estabelecidas as condições para a interacção célula-microambiente que se assemelha ao microambiente in vivo. Este artigo fornece uma metodologia detalhada para cultivar células de câncer de mama em uma matriz de proteínas de membrana basal 3D, exemplificando o potencial da cultura 3D na avaliação da invasão celular no ambiente circundante. Além disso, iremos discutir como estes ensaios 3D tem o potencial para analisar a perda de sinalização Molecules que regulam a morfologia epitelial por imunomarcação procedimentos. Estes estudos ajudar a identificar detalhes importantes mecanicistas nos processos que regulam a invasão, necessários para a propagação do câncer de mama.

Um exemplo de MDA-MB-231 em células invasoras matriz 3D é ilustrada na Figura 3C. As células são incorporados na matriz (Dia 1) e começam a formar-(estreladas) estruturas invasoras no Dia 3, e invadir completamente para dentro da matriz por Dia 5 (Figura 3C). O número de colónias formadas estreladas são contadas, e expressas como uma percentagem do número total de colónias por placa (invasivos e não invasivos). Além disso, uma vez que as medições são feitas diariamente du...

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Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Este artigo proporciona metodologias detalhadas para a utilização de ensaios tridimensionais (3D), para quantificar a invasão das células do cancro da mama. Especificamente, vamos discutir os procedimentos necessários para a criação de tais ensaios, quantificação e análise de dados, bem como métodos para analisar a perda da integridade da membrana que ocorre quando as células invadem.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de Câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Medicina

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotípica tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

A Cultura de Tecidos modelo tridimensional para estudar primária da medula óssea humana e suas Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Início do Carcinoma de mama metastático por Segmentação do ductal Epithelium com Adenovírus-Cre: Um Modelo Novel de camundongo transgênico do Câncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...