Name: setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Vi takker alle de medlemmer af Lenne og Bertrand laboratorier, især Olivier Blanc for softwareudvikling og Jérémie Capoulade til diskussion. Vi takker også PICsL-IBDM imaging facilitet, især Claude Moretti og Brice Detailleur for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af ATIP tilskud fra CNRS (til P.-FL og VB), det LABEX INFORM tilskud (til P.-FL og VB) og en bevilling fra Sanofi-Aventis (til VB). Vi anerkender France-bioimaging infrastruktur støttes af Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, kalder &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1.. Opsætning af Light ark og Path Detection Figur 1 giver en generel ordning af den optiske setup. <ol><li> Placer og fastgør mikroskopet og lasere på den optiske bordet. </li><li> Kombiner lasere 488 nm, 561 nm og 405 nm med de tilsvarende dichroiske spejle. Efter dikroiske spejle, lasere skal netop co-linie. Bemærk, at valget af laserbølgelængder, dikroiske spejle og optiske filtre bestemmes ud fra absorptionsspektret af de specifikke fluorescerende mærker, der anvendes i forsøgene. </li><li> Placer akustisk optisk afstemmelige filter (AOTF). Brug testarket tilvejebragt af leverandøren for at justere frekvensen og magt AOTF. Når godt afstemt, er omkring 90% af lasereffekten transmitteres ved en maksimal tuning målt ved en powermeter. Bemærk, at nogle lasere kan være fuldt kontrolleret af software, som kunne gøre AOTF unødvendig. </li><li> Placer og løseteleskopet. Bemærk, at teleskopet er sammensat af to linser, der udvider strålen til en bredde lig med eller større end diameteren af ​​ryggen blænde belysning objektivlinsen. Objektivet med den mindste brændvidde bør komme først. </li><li> Sted, justere og fastsætte periskopet bringer opad den optiske vej tættere på bagsiden blænde af den cylindriske linse. Bemærk, at de to spejle af periskopet er monteret på en måde, at deres lange akse er om på hældningen af ​​spejlet for at afspejle den fuldt ekspanderede stråle. </li><li> Placer cylindrisk linse ved siden af ​​periskop exit. Bemærk, at den cylindriske linse fokuserer strålen i en retning og lader det kollimeres i den anden retning, hvorved der dannes en plade lys. </li><li> Koncentrere den resulterende lys ark ved hjælp af belysning objektiv. Bemærk, at billedet omdrejningspunktet for belysningen målet bør være sammenfaldende med det formål omdrejningspunkt af målet afsløring. Projekt strålenpå en skærm (fx en væg) på lang afstand. Flyt belysning mål langs belysningsstrålen akse for at få på skærmen skarpe konturer af lys ark. </li><li> Placer quad linje (405/488/561/638) emission filter i stedet reserveret i mikroskop (terning). </li><li> Anbring EMCCD kamera på mikroskop output port. </li><li> Fastgør den første manuelle oversættelse etape på mikroskopbordet af skruer i huller boret i mikroskopbordet. Bemærk, at kanten af ​​translationstrinnet skal placeres omkring 2 cm fra centrum af mikroskopbordet, således at kuvetten er centreret under detektionsgrænsen objektivlinsen. </li><li> Fastgør den anden manuelle oversættelse etape på den første. De retninger af to etaper skal være vinkelret (X og Y oversættelser). </li><li> Fastgør Z piezoelektriske scenen på toppen af ​​de to foregående etaper. Bemærk, at en motoriseret trin kan anvendes i stedet for det piezoelektriske fase. </li><li> Fastgør kuvetten keepr (se figur 2) på toppen af disse faser. Kuvetten vil således blive placeret i skæringspunktet mellem belysningen sti og påvisning vej, som er vinkelrette på hinanden. </li></ol> 2.. Kontrol af Light Sheet <ol><li> Fyld et glas kuvette med fluorescerende løsning, og placere den på prøveholderen i skæringspunktet for de to optiske stier. Lyspladen er således synlige. Det skal være vandret, og symmetrisk / centreret i forhold til påvisning objektivlinsen. </li><li> Fjern cylindrisk linse og erhverve et billede for at måle tykkelsen af ​​lyspladen. Bemærk, at tykkelsen af ​​lyspladen afhænger numeriske apertur (NA) for belysningen objektivlinsen (3-4 um til NA = 0,3). Bemærk, at for en given linse, kan tykkelsen af ​​det lys ark øges ved at reducere størrelsen af ​​strålen ind i ryggen blænde med en spalte. Bemærk, at fluorescerende mikrosfærer kan anvendes til at måle øksenial og lateral opløsning af mikroskopet. </li><li> Sæt tilbage cylindrisk linse, før du starter eksperimentet. </li></ol> 3.. Monteringen C. elegans Embryoner De følgende trin er afbilledet i figur 3. <ol><li> Brug en diamant-mærkning pen til at skære et stykke af en glasplade på 10 x 20 x 1 mm. </li><li> Forbered 5% bacto-agar i vand, kog det og vedligeholde det i en varmeblok ved 60 ° C. </li><li> Tilsæt 50 ul af poly-L-lysin på den ene side af snittet stykke dias, lad det tørre. </li><li> Placer et objektglas på bænken og ordne det. </li><li> Sidestiller det afskårne stykke dias med fast dias og tilføje en dråbe smeltet agar på toppen. Klem agar Brug en anden ren objektglas for at opnå en tynd agar pad. </li><li> Lad agar pad til at tørre, før du fjerner den øverste dias. </li><li> Skær agar pude på den side af den faste slide for at give et overskud på cirka 3 mm of agar og forsigtigt fjerne den faste dias. </li><li> Tilsæt 50 ul af poly-L-lysin på agar og lad det tørre helt. </li><li> Put GRAVID orme i M9 medium i et urglas. </li><li> Skær orme på niveauet af vulva med en skalpel for at frigøre embryoner. </li><li> Under en kikkert identificere de embryoner i den fase af interesse og samle dem ved hjælp af en mikrokapillær pipette. </li><li> Placer embryoner på den del af agar overtrukket med poly-L-lysin, der rager ud fra det afskårne stykke af dias. Placer embryoner lige ved siden af ​​grænsen til diaset. Må ikke placere embryoner ved grænsen af ​​agar, fordi de ikke vil være stabil nok. Fjern forsigtigt væsken, så at embryonerne vil holde på poly-L-lysin lag. </li><li> Justeres hurtigt embryoner for at undgå udtørring. </li><li> Den overskårne dias i en plastik petriskål og forsigtigt tilføje M9 medium til at dække diaset. </li><li> Kontroller under en kikkert at æggene stadig sidder fast på agaren. </li&gt; </ol> 4.. Registrering af C. elegans Development <ol><li> Fastgør den tidligere forberedelse (skåret slide, agar plus embryoner) i prøveholderen og læg den i en kuvette. Figur 4 beskriver den hjemmelavede holder og 5 viser et billede af kuvetten i observation sammenhæng. </li><li> Lave kuvetten på piezoelektriske fase. </li><li> Identificer placeringen af ​​fostre med lyse felt belysning. </li><li> Start hjemmelavet software styrer AOTF&#39;en, kameraet og piezoelektriske scenen. Bemærk, at en fri software, såsom micromanager, kan også anvendes. </li><li> Vælg laser linje og magt (AOTF). </li><li> Juster placeringen af ​​lyset ark ved hjælp af 3 retninger fase støtter cylindrisk linse og belysning linse. Flyt scenen langs den laterale retning (X) for at opnå den klareste signal. Juster derefter Z-position lyspladen og langsgående position (Y) for at opnå the bedste signal støjforhold. Bemærk, at positionen af ​​lyspladen fokus skal måske justeres fra et embryon til et andet for at korrigere forskelle i lyse vejlængder. </li><li> At erhverve time-lapse billeder, skal du vælge eksponeringstid, vinde, tiden mellem to billeder, såvel som antallet af billeder, der skal erhverves, og laser magt. For 2 farve erhvervelse, skal du vælge en anden laser linje. To farvebilleder erhverves fortløbende. </li><li> At erhverve az stak, også vælge afstanden mellem de to skiver, og begyndelsen og slutter positioner af piezoelektriske. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Denne protokol beskriver en nem opsætning af lys plade mikroskopi til in vivo billeddannelse af C. elegans embryoner. De optiske elementer, der er nødvendige for at skabe og tilpasse lyset ark, herunder lasere, stråle expander, kollimation og fokusere linser, kan nemt monteres på en optisk bænk. I kombination med en opretstående mikroskop til påvisning sti og kameraet, giver det en enkel løsning at sætte en plade lys mikroskop. Denne geometri gør prøven miljø enkel. Den levende Prøven anbringes i en glaskuvette, som holdes, placeret og bevæges af et lille sæt af mekaniske dele. Da ark belysning mikroskopi er et bredt felt teknik med sektionering kapacitet, er det kun en enkelt akse motoriseret bevægelse kræves til 3D-billedbehandling. Dette begrænser kravet om synkronisering til en enkelt scanning element og letter softwareudvikling. Sammenlignet med ISPIM 6 vores opretstående geometriskRy tillader brug af høj NA objektiv til detektion. Sammenlignet med spim opsætninger med objektive linser i det vandrette plan montering af prøven og billedbehandling af en serie af embryoner er lettere. Sammenlagt gennemførelsen af ​​denne teknik er ligetil og kan opnås med lidt ekspertise i optik. Dette er et billigere alternativ til konfokale mikroskoper med fordelene ved en højere hastighed og reduceret fototoksicitet men ulempe ved en lavere aksial opløsning. Vi har også udviklet en nem og reproducerbar måde at montere C. elegans embryoner til in vivo billeddannelse ved hjælp af dette system. Monteringen er hurtig (15 min) og er velegnet til dagligdags eksperimenter. For C. elegans billeddannelse, fordelene ved denne simple setup er mindst to folder: (i) in toto billeddannelse er mulig uden rotation og dermed 3D rekonstruktion er ligetil; (Ii) prøve montering er enkelt og flere embryoner kan sekventielt afbildespå samme dias. Vi viste eksempler på time-lapse film med tilstrækkelig tidsopløsning at observere celledelinger og celle form ændringer. Effekten af lys plade mikroskopi at studere C. elegans udvikling er også for nylig blevet vist af andre 6, 7, 8. Derfor vil denne teknik være meget nyttigt at undersøge morfogenese og mønstret af C. elegans foster. Kan dette system også bruges til at analysere udviklingen af ​​andre modelorganismer? Det er vigtigt at erkende, at gennemførelsen af arket belysning mikroskopi for små og gennemsigtig organisme såsom C. elegans er lempeligere end for større organismer såsom Drosophila embryoner. I toto billeddannelse af Drosophila normalt kræver rotation og multi-view rekonstruktioner 9, 10. Ekscitation fra to sider med kolineære excitation objektive objektiver kan også reduceret skyggevirkninger forårsaget af attenuation af lys 11. Alligevel er opsætningen præsenteres her stadig tilpasset billede ene side af Drosophila embryoner med lav blegning og lav photoxicity. Denne opsætning kan også være nyttigt at billedet små og gennemsigtige embryoner såsom søpunge eller zebrafisk.

Dannelsen og formning af en organisme involverer celle bevægelser, celle form ændringer, celledeling og celledifferentiering. Forståelse af progression og koordinering af disse processer kræver hurtige billedbehandling værktøjer med tre dimensioner kapacitet og subcellulær opløsning. Blandt de teknikker med disse in vivo billeddannelse kapaciteter, også let plade belysning mikroskopi kaldet enkelt / selektiv plane illumination mikroskopi har den unikke fordel at producere lav-fototoksisk effekter og lav-fotoblegning 1,2. I ark belysning mikroskopi prøven belyses fra siden af ​​en let plade, som udfører den optiske sektionering. Belysningen sti og detekteringsbanen er vinkelrette på hinanden og lyspladen er justeret til at falde sammen med det formål brændplan påvisning objektivlinsen. Prøven er placeret ved krydset mellem de to veje, ennd kan bevæges langs påvisning aksen for at muliggøre 3D-billedbehandling. Kun planet af interesse belyst og alle punkter i dette plan detekteres samtidigt. Dette øger betydeligt købet hastighed og reducerer fotoblegning samt fototoksicitet i forhold til konfokal mikroskopi 3. Praktisk, ark belysning mikroskopi er let at installere og align: for to dimensionelle billeder, er nødvendig hverken til påvisning del, heller ikke til belysning varenr scanning; som et bredt felt teknik med sektionering kapacitet, kan tre-dimensionelle billeder opnås ved en enkelt akse bevægelse af scenen holder prøven. Her præsenterer vi oprettelsen af en simpel plade lys mikroskop og dens gennemførelse i toto billeddannelse af C. elegans embryoner. C. elegans embryoner er velegnede til at leve i vivo imaging på grund af deres gennemsigtighed, invariant afstamning og stereotype celle positioner 4,5. Den udviklede lys setup ark er baseret på en standard opretstående mikroskop til detektering. Protokollen præsenteret nedenfor detaljer, hvordan man opbygger og tilpasse excitation modul / vej, test og karakterisere lys plader og montere prøven til 3D-billedbehandling. Det giver også eksempler på time-lapse film erhverves med opsætningen på forskellige stammer, der udtrykker fluorescerende markører.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Hurtig og lav fototoksiske billeddiagnostiske teknikker er forudsætning for at studere udviklingen af organismer i toto. Light plade baseret mikroskopi reducerer fotoblegende og fototoksisk effekt i forhold til konfokal mikroskopi, men samtidig give 3D-billeder med subcellulær opløsning. Her præsenterer vi opsætning af en plade lys baseret mikroskop, der består af en opretstående mikroskop og et lille sæt af opto-mekaniske elementer til generering af lyspladen. Protokollen beskriver, hvordan man opbygger, justere mikroskopet og karakterisere lys ark. Desuden er det i detaljer, hvordan man gennemfører metoden til in toto billeddannelse af C. elegans embryoner ved hjælp af en simpel observation kammer. Metoden gør det muligt at fange 3D to farver time-lapse film over par timers udvikling. Dette skulle lette sporing af cellens form, celledelinger og mærkede proteiner over lange perioder.

Tre 3D time-lapse optagelse eksperimenter fra tre forskellige C. elegans stammer illustrere den type data, der kan opnås ved hjælp af lys plade mikroskop setup beskrevet ovenfor. Vi checkede, at under disse betingelser fostrene udvikler med normal hastighed og overleve billedbehandling, i overensstemmelse med tidligere rapporter, der indikerer, at SPIM imaging forårsager kun lave fototoksicitet niveauer i C. elegans embryoner 6,7. Den første stamme udtrykker et histon fusioneret til GFP (zuIs178; stIs10024). Optagelse blev udført i løbet af 2 timer med en stak af 20 skiver (afstand mellem skiver 1 um) tages hver 37 sek. Figur 6 viser et plan af stablen på forskellige tidspunkter. Begge interphasic kerner (pilen) og kondenseret mitotiske kromatin (pil hoved) er klart synlige. Den anden stamme udtrykker et tubulin fusioneret til GFP (ruIs57) og en histonfusioneret til mCherry (itIs37; stIs10226). Optagelse blev udført i løbet af 16 min med en stak på 20 skiver (afstanden mellem skiver 1 um) tages hver 105 sek. Figur 7 illustrerer forskellige planer af stablen og forskellige tidspunkter. Den tilhørende film 1 viser 3D, rekonstruktioner på 3 på hinanden følgende tidspunkter. Under division, den mitotiske spindel (grøn) og kondenserede kromosomer (rød) er klart synlige tillader sporing af celledeling orienteringer under udviklingen. Den tredje stamme udtrykker apolipoprotein VIT-2 fusioneret til GFP (pwIs23) og en membranbundet mCherry (ltIs44). Optagelse blev udført i 25 min med en stak af 10 skiver (afstand mellem skiver 1 um) tages hver 30 sek. Figur 8 illustrerer forskellige planer af stablen og forskellige tidspunkter. De hurtige bevægelser af æggeblomme lipoprotein partikler (grøn) i cellerne kan letfølges. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1: SPIM optisk setup bestående af belysning og afsløring enheder, front og bund synspunkter. I belysningsenhed, lasere kombineres af dikroiske spejle indtaste AOTF, som styrer effekten af ​​hver laser uafhængigt. Derefter teleskopet øger størrelsen af ​​strålen med 4 gange og periskop bringer det til højden af ​​mikroskopet. Den cylindriske linse danner lyspladen, der er fokuseret ved belysningen mål. Detektionsenheden er integreret i opretstående mikroskop og består hovedsageligt af påvisning linse, filteret, røret linsen og EMCCD. Prøven er placeret i skæringspunktet mellem belysning og afsløring stier. Piezoelektrisk fase tillader lodrette (Z) forskydninger af prøventil 3D-erhvervelse. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2:. Kuvetteholder Indehaveren består af 3 aluminiumsplader og skrues på den piezoelektriske scenen. Den glaskuvette holdes af en fjeder (i rødt). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3: Montering protokol C. elegans embryoner til spim eksperimenter. En nedskæring stykke glas er belagt med poly-L-lysin. En pude af agar er placeret på den belagte overflade. Poly-L-lysin tilsættes derefter på agar pad. Endelig C. elegans embryoner er afstemt på poly-L-lysin belagt agar pad. Figur 4: Eksempel på holder. Indehaveren passer til de indvendige dimensioner af glaskuvette. To fjedre (rødt) holde objektglasset (beskrevet i figur 3). Denne holder derefter sætte ind i glaskuvette. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5:... Proeveholder i observation sammenhæng Fostre er immobiliseret på objektglas i henhold til protokollen opsummeres i Figur 3 dias holdes af prøveholderen beskrevet i figur 4 Prøveholderen er indsat i glaskuvette, holdes af holderen, der er beskrevet i fig. 2. Lyset ark er vandret, og illuminates embryoner fra siden. Påvisningen objektiv er lodret over prøven. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Figur 6: Registrering af en C. elegans foster udtrykke en histon :: GFP fusion Single plane billeder af en transgen foster udtrykke en histon :: GFP-fusion (zuIs178, stIs10024) på forskellige tidspunkter Billeder udvundet fra en 3D tidsforskudt optagelse:.. stakke lavet af 20 skiver ( Afstanden mellem skiver 1 um); eksponeringstid per skive: 30 msek; tidsintervallet mellem stakke: 37 sek; samlede erhvervelse tid: 2 timer. Pil: interphasic kerne, pil hoved: kondenseret mitotisk kromatin. Ved t = 0 min fosteret er ved 2-celle stadiet og ved t = 120 min embryo indeholder omkring 70 celler som forventet under normale udviklingsmæssige stissede (bemærk at kun de celler, der er indeholdt i et enkelt plan er synlige på billederne, og ikke alle celler i embryonet). Den effekt af belysning var 30 uW ved 488 nm (målt ved udgangen af belysningen målsætning). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Klik her for at se denne video.</a> <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7: Optagelse af en C. elegans embryo udtrykker en tubulin :: GFP-fusion og en histon :: mCherry fusion. Images udvundet fra en 3D tidsforskudt optagelse af en C. elegans embryo udtrykker en tubulin :: GFP-fusion (ruIs57) og en histon :: mCherry fusion (itIs37, stIs10226). Optageforhold: køb af en stak af 20 skiver (afstanden mellem skiver 1um) hver 105 sek; samlede erhvervelse tid: 16 min; eksponeringstid: 200 msek for hver kanal. Panel A viser 10 skiver af den samme stak. Panel B viser den samme skive hver 210 sek. Den effekt af belysning var 30 uW og 300 pW, for 488 og 561 nm lasere, henholdsvis (målt ved afgangen fra belysningen målsætning). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Klik her for at se denne video.</a> <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8: Optagelse af en C. elegans embryo udtrykker en VIT-2 :: GFP fusion og en membran-målrettet mCherry. Images udvundet fra en 3D tidsforskudt optagelse af en C. elegans embryo udtrykker en VIT-2 :: GFP fusion (PWIS23) og en membran-målrettet mCherry (ltIs44). Optageforhold: køb af en stak af 10 skiver (afstanden mellem skiver 1 um) hver 30 sek; samlede erhvervelse tid: 25 min; eksponeringstid per kanal: 200 msek. Panel A viser de 5 første skiver af den samme stak. Panel B viser den samme skive hver 30 sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Klik her for at se denne video.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Opsætning af en Simple Light Sheet mikroskop for<em&gt; I Toto</em&gt; Imaging af<em&gt; C. elegans</em&gt; Udvikling

Denne protokol beskriver opsætningen af en lys plade mikroskop og dens gennemførelse til in vivo billeddannelse af C. elegans embryoner.

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

En fremgangsmåde til dyrkning Embryonale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Målinger af fysiologiske stressreaktioner i C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Måling ran peptid toksicitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...