Name: setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Vi takker alle medlemmer av Lenne og Bertrand laboratorier, særlig Olivier Blanc for programvareutvikling og Jérémie Capoulade for diskusjon. Vi takker også PICsL-IBDM bildebehandling anlegget, spesielt Claude Moretti og Brice Detailleur for teknisk support. Dette arbeidet ble støttet av ATIP tilskudd fra CNRS (til P.-FL og VB), den LABEX INFORMERE stipend (til P.-FL og VB) og et stipend fra Sanofi-Aventis (til VB). Vi erkjenner France-Bioimaging infrastruktur støttes av Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-INSB-04-01, kaller &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

En. Sette opp Lett bladet og Detection Sti Figur 1 gir en generell ordning for den optiske oppsettet. <ol><li> Plasser og fikse mikroskopet og lasere på den optiske bordet. </li><li> Kombiner lasere 488 nm, 561 nm og 405 nm med de tilsvarende dichroic speil. Etter at de dikroiske speil, lasere må være nøyaktig ko-linje. Legg merke til at valg av laserbølgelengder, dikroiske speil, og optiske filtre blir bestemt fra det absorpsjonsspektra av de spesifikke fluorescerende markører som brukes i eksperimentene. </li><li> Plasser akustisk-optisk tunbare filter (AOTF). Bruk testarket gitt av leverandøren for å justere frekvensen og kraften i AOTF. Når vel-justert, blir omtrent 90% av lasereffekten som overføres til en maksimal innstilling målt ved en Power. Merk at noen lasere kan være fullt kontrollert av programvare, noe som kan gjøre AOTF unødvendig. </li><li> Plasser og fikseteleskopet. Legg merke til at teleskopet er sammensatt av to linser som utvider strålen til en bredde lik eller større enn diameteren på baksiden åpning av belysning objektiv. Objektivet med den minste brennvidde bør komme først. </li><li> Sted, justere og fikse periskop bringe oppover den optiske banen nærmere tilbake blenderåpning på den sylindriske linsen. Legg merke til at de to speil av periskopet er montert på en slik måte at deres lengdeakse er legging av helningen av speilet for å reflektere den fullt ekspanderte stråle. </li><li> Plasser sylindrisk linse ved siden av periskop exit. Legg merke til at den sylindriske linse fokuserer strålen i en retning og forlater den kollimeres i den andre retningen, hvorved det dannes en lett arket. </li><li> Refokusere den resulterende lyse ark ved hjelp av belysning objektiv. Legg merke til at bildemidtpunktet i belysnings formålet bør falle sammen med den gjenstand brennpunktet til objektivet deteksjon. Projisere strålenpå en skjerm (for eksempel en vegg) ved lang avstand. Beveg belysnings målet langs belysningsstråleaksen for å oppnå på skjermen skarpe konturer av lyset arket. </li><li> Plasser quad linjen (405/488/561/638) utslipp filter i stedet reservert i mikroskop (kube). </li><li> Plasser EMCCD kamera på mikroskop utgang. </li><li> Fest første manuell oversettelse scenen på mikroskopet scenen med skruer i hull boret i mikroskopet scenen. Legg merke til at kanten på oversettelsen fasen har til å bli plassert på ca 2 cm fra sentrum av den objektbord, slik at kuvetten er sentrert under deteksjons objektiv. </li><li> Fest andre manuell oversettelse scenen på den første. Retningene av de to faser å være perpendikulær (X og Y) oversettelser. </li><li> Fest Z piezoelektriske scenen på toppen av de to foregående etapper. Legg merke til at en motorisert trinn kan anvendes i stedet for det piezoelektriske stadium. </li><li> Fest cuvette holr (se figur 2) på toppen av prøvene. Kyvetten vil således bli plassert i skjæringspunktet mellom belysningsbanen og påvisning banen, som står vinkelrett på hverandre. </li></ol> 2. Kontrollere Lett Sheet <ol><li> Fyll et glass kyvette med fluoriserende løsning, og plassere den på prøveholderen i skjæringspunktet mellom de to optiske stier. Lyset arket er dermed synlig. Det må være horisontal, og symmetrisk / sentrert med hensyn til påvisning objektiv. </li><li> Fjern den sylindriske linse og erverve et bilde for å måle tykkelsen av lyset arket. Merk at tykkelsen av det lys arket er avhengig av den numeriske apertur (NA) for belysning objektivlinse (omtrent 3 til 4 mikrometer for NA = 0,3). Legg merke til at for en gitt linse, kan tykkelsen av det lys-arket økes ved å redusere størrelsen av strålen går inn i baksiden aperture med en spalte. Legg merke til at fluorescerende mikrosfærer kan anvendes for å måle axial og lateral oppløsning av mikroskopet. </li><li> Sett tilbake sylindrisk linse før start av eksperimentet. </li></ol> Tre. Monteringen av C. elegans embryo Følgende trinn er avbildet i figur 3. <ol><li> Bruk en diamant-tusjpenn for å klippe et stykke av en glass-slide på 10 x 20 x 1 mm. </li><li> Forbered 5% Bacto-agar, vann, koke den og holde den i en varmeblokk ved 60 ° C. </li><li> Tilsett 50 pl av poly-L-lysin på én side av den avkappede slide, la den tørke. </li><li> Plasser et objektglass på benken og fikse det. </li><li> Sidestille den avkappede lysbilde med fast lysbilde og legge en dråpe smeltet agar på toppen. Klem agar med en annen rent objektglass for å få tak i en tynn agar pad. </li><li> La agar pad for å tørke før du fjerner den øverste lysbildet. </li><li> Skjær agar platen på siden av den faste glide for å la et overskudd av omtrent 3 mm of agar og fjern forsiktig den faste lysbildet. </li><li> Tilsett 50 mL av poly-L-lysin på agar og la det tørke helt. </li><li> Sett av gravid ormer i M9 medium i et urglass. </li><li> Skjær ormene på nivået av vulva med en skalpell for å frigjøre embryoene. </li><li> Under en kikkert identifisere embryoene på scenen for interesse og samle dem ved hjelp av en microcapillary pipette. </li><li> Plasser embryoene på den delen av agar belagt med poly-L-lysin som stikker ut fra den avkappede lysbilde. Plasser embryoene like ved grensen til lysbildet. Ikke plasser embryoene på grensen av agar fordi de ikke vil være stabil nok. Fjern forsiktig væsken slik at embryoene vil holde seg på poly-L-lysin-laget. </li><li> Raskt justere embryoene for å unngå uttørking. </li><li> Plasser kuttet lysbilde i en plast petriskål og tilsett M9 medium for å dekke lysbildet. </li><li> Sjekk under en kikkert at eggene er fortsatt fast på agar. </li&gt; </ol> 4. Innspillingen av C. elegans Development <ol><li> Fest tidligere forberedelse (cut lysbilde, agar pluss embryoer) i prøven holderen og legg den i en kyvette. Figur 4 beskriver den hjemmelagde holderen og Figur 5 viser en visning av kyvetten i observasjonssammenheng. </li><li> Fest kyvetten på piezoelektrisk scenen. </li><li> Identifisere posisjonen av embryoene med lyse felt belysning. </li><li> Start hjemmelaget programvare styrer AOTF, kameraet og den piezoelektriske scenen. Legg merke til at en fri programvare, for eksempel micro, kan også anvendes. </li><li> Velg laserlinjen og makt (AOTF). </li><li> Justere posisjonen av lyset arket ved hjelp av tre retninger fasen støtte den sylindriske linse og belysnings linsen. Beveg fasen langs sideretningen (X) for å oppnå den sterkeste signalet. Juster deretter Z-posisjonen av lyset papiret og de langsgående stilling (Y) for å oppnå the beste signal til støy-forhold. Legg merke til at plasseringen av det lys arket fokus kan måtte justeres fra en embryo til en annen for å korrigere forskjeller i lysbanen lengder. </li><li> Å tilegne seg tid-lapse bilder, velger eksponeringstiden, får, tid mellom to bilder, samt antall bilder som skal erverves, og lasereffekten. For to farger oppkjøpet, velg en annen laserlinje. To fargebilder er ervervet etter hverandre. </li><li> For å skaffe az stabelen, også velge avstanden mellom de to skiver, og start-og sluttposisjoner av det piezoelektriske. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne protokollen beskriver en enkel installasjon av lys ark mikroskopi for in vivo avbildning av C. elegans embryoer. De optiske elementer som er nødvendige for å skape og justere lyset ark, inkludert lasere, bjelke ekspander, collimation og fokus linser, kan enkelt monteres på en optisk benk. I kombinasjon med en opprettstående mikroskop for påvisning banen og kameraet, gir dette en enkel løsning for å sette opp et lett ark mikroskop. Denne geometrien gjør prøven miljø enkel. Den levende Prøven blir plassert i en glass kyvetten, som holdes, plasseres og beveges av et lite sett av mekaniske stykker. Som ark belysning mikroskopi er et bredt felt teknikk med seksjonering evne, er bare en enkelt akse motorisert bevegelse som kreves for 3D avbildning. Dette begrenser kravet om synkroniseringen til et enkelt scanning element og muliggjør utvikling av programvare. Sammenlignet med iSPIM seks vår oppreist GEOMETry tillater bruk av høy NA objektiv for deteksjon. Sammenlignet med SPIM oppsett med objektiv i horisontalplanet monteringen av prøven og bildebehandling av en serie av embryoer er lettere. Til sammen er gjennomføringen av denne teknikken grei og kan oppnås med liten kompetanse på optikk. Dette er et billigere alternativ til confocal mikroskop med fordelene ved en høyere hastighet og lavere fototoksisitet, men ulempen med en nedre aksial-oppløsning. Vi har også utviklet en enkel og reproduserbar måte å montere C. elegans embryoer for in vivo avbildning ved hjelp av dette systemet. Monteringsfremgangsmåten er hurtig (15 min) og er egnet for vanlige eksperimenter. For C. elegans bildebehandling, fordelene ved dette enkle oppsettet er minst to-folder: (i) i toto bildebehandling er mulig uten rotasjon og dermed 3D rekonstruksjon er grei; (Ii) prøven montering er enkel og flere embryoer kan sekvensielt avbildespå samme lysbilde. Vi viste eksempler på filmer med tidsintervall med tilstrekkelig tidsmessig oppløsning til å observere celledelinger og celle form endringer. Kraften i lys ark mikroskop for å studere C. elegans utvikling har også nylig blitt vist av andre, 6, 7, 8.. Derfor vil denne metoden være svært nyttig å studere morfogenese og fordelingen av C. elegans embryo. Kan dette systemet også anvendes til å analysere utviklingen av andre modellorganismer? Det er viktig å erkjenne at gjennomføringen av arket lys mikroskopi for små og gjennomsiktig organisme, for eksempel C. elegans er mindre strenge enn for større organismer som Drosophila embryoer. In toto avbildning av Drosophila krever normalt rotasjon og multi-view rekonstruksjoner 9, 10. Eksitasjon fra to sider med kollineære eksitasjon objektiv kan også redusert skyggeeffekter forårsaket av attenuation av lys 11. Likevel, er oppsettet presenteres her fortsatt tilpasset image ene siden av Drosophila embryoer, med lav bleking og lav photoxicity. Dette oppsettet kan også være nyttig å avbilde små og gjennomsiktige embryoer som sjøpung eller sebrafisk.

Dannelsen og forming av en organisme som omfatter cellebevegelser, celle form endres, celledeling og celledifferensiering. Forstå progresjon og koordinering av disse prosessene krever raske tenkelig verktøy med tre dimensjoner evne og subcellulære oppløsning. Blant de teknikker med disse in vivo imaging evner i lys ark lys mikros også kalt enkelt / selektiv belysning plane mikroskopi har den unike fordelen av å produsere lave fototoksiske effekter og lav-photobleaching 1,2. I arket belysning mikroskopi blir prøven belyses fra siden av en lys ark, som utfører den optiske snitting. Belysnings bane og påvisning banen er vinkelrett på hverandre og lyset arket er innrettet til å falle sammen med objektet fokalplanet for påvisning objektiv. Prøven blir plassert i skjæringspunktet mellom de to linjene, ennd kan beveges langs aksen for å tillate deteksjon 3D avbildning. Bare planet av interesse er tent og alle punktene i dette plan blir detektert på samme tid. Dette øker anskaffelseshastigheten og reduserer i tillegg fotobleking som fototoksisitet sammenlignet med konfokal mikroskopi 3.. Praktisk talt, er ark belysning mikros enkelt å sette opp og align: for todimensjonal avbildning, er nødvendig verken for påvisning del, og heller ikke for belysning del ingen scanning; som en bred-felt teknikk med seksjonering evne, kan tre-dimensjonale avbildning kan oppnås ved en enkelt akse bevegelse av fasen holde prøven. Her presenterer vi opprettelsen av et enkelt lys ark mikroskop og gjennomføringen for i toto avbildning av C. elegans embryoer. C. elegans embryoer er godt egnet til å leve i vivo imaging på grunn av sin åpenhet, invariant avstamning og stereotyp celle posisjonerer 4,5. Den utviklede lette ark oppsettet er basert på en standard oppreist mikroskop for påvisning. Protokollen presenteres nedenfor viser hvordan du kan bygge og justere eksitasjon modul / sti, test og karakter lyset ark og montere prøven for 3D avbildning. Det gir også eksempler på time-lapse filmer ervervet med oppsettet på ulike stammer som uttrykker fluorescerende markører.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Raske og lave fototoksiske bildeteknikker er forutsetning for å studere utviklingen av organismer i toto. Lett bladet basert mikros reduserer foto-bleking og fototoksiske effekter i forhold til konfokalmikroskopi, samtidig som det gir 3D-bilder med subcellulære oppløsning. Her presenteres oppsettet av et lett bladet basert mikroskop, som består av en opprettstående mikroskop og et lite sett av opto-mekaniske elementer for generering av lys arket. Protokollen beskriver hvordan du kan bygge, justere mikroskop og karakter lyset arket. Videre detaljer det hvordan å implementere fremgangsmåten for in toto avbildning av C. elegans embryo ved hjelp av en enkel observasjon kammer. Metoden tillater fangst av 3D-to-farger time-lapse filmer over noen timer med utvikling. Dette bør lette sporing av celleform, celledelinger og kodede proteiner over lange tidsperioder.

Tre 3D-time-lapse opptak eksperimenter fra tre forskjellige C. elegans stammer illustrere hvilken type data som kan oppnås ved bruk av lys ark mikroskop oppsett beskrevet ovenfor. Vi sjekket at under disse forholdene embryoene utvikler ved normal hastighet og overleve bildebehandling, i samsvar med tidligere rapporter som indikerer at SPIM bildebehandling fører bare lave fototoksisitetsnivåer i C. elegans embryoer 6,7. Den første belastning uttrykker en histone smeltet til GFP (zuIs178; stIs10024). Opptaket ble utført i løpet av 2 timer med en stabel av skiver 20 (avstand mellom skivene 1 mikrometer) tatt hver 37 sek. Figur 6 illustrerer ett plan i stabelen ved ulike tidspunkt. Begge interphasic kjerner (pil) og kondensert mitotisk kromatin (pil hode) er godt synlig. Den andre belastningen uttrykker en tubulin smeltet til GFP (ruIs57) og en histonesmeltet til mCherry (itIs37; stIs10226). Opptak ble utført i løpet av 16 min med en bunke med 20 skiver (avstand mellom skiver 1 mikrometer) tatt hver 105 sek. Figur 7 illustrerer forskjellige plan av stabelen og ulike tidspunkt. Den tilhørende film 1 Viser 3D rekonstruksjoner på tre påfølgende tidspunkter. Under divisjon, mitotisk spindel (grønn) og kondensert kromosomer (røde) er godt synlig slik at sporing av celledeling orienteringer under utvikling. Den tredje belastning uttrykker apolipoprotein VIT-2 smeltet til GFP (pwIs23) og en membran bundet mCherry (ltIs44). Opptak ble utført i løpet av 25 min med en bunke med 10 skiver (avstand mellom skiver 1 mikrometer) tatt hver 30 sek. Figur 8 illustrerer forskjellige plan av stabelen og ulike tidspunkt. Den raske bevegelser av plomme lippoproteinpartikler (grønn) i cellene kan lett blifulgt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1: SPAM optisk oppsettet består av belysning og gjenkjenning enheter, foran og bunn utsikt. I belysningsenheten, de kombinerte lasere av den dikroiske speil går inn i AOTF, som kontrollerer strømmen av hver laser uavhengig. Da teleskopet øker størrelsen av strålen ved 4 ganger og den periskop bringer den til høyden av mikroskopet. Den sylindriske linse danner lys-ark, som er refocused ved belysning målet. Den deteksjonsenheten er integrert i oppreist mikroskop og er hovedsakelig sammensatt av deteksjons linse, filteret, røret linsen og EMCCD. Prøven blir plassert i skjæringspunktet mellom belysning og deteksjon baner. Et piezoelektrisk trinn tillater fall (Z) forskyvninger av prøvenfor 3D-oppkjøpet. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2:. Kyvetteholderen Holderen består av tre aluminiumplater og er skrudd på den piezoelektriske stadium. Glasset kyvetten er holdt av en fjær (i rødt). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3: Montering protokoll av C. elegans embryoer for SPIM eksperimenter. Et kutt stykke glass belagt med poly-L-lysin. En pute av agar er plassert på den belagte flate. Poly-L-lysin tilsettes deretter ut på agar puten. Endelig C. elegans embryoer er justert på poly-L-lysin belagt agar pad. Figur 4: Eksempel på holderen. Holderen passer til de innvendige dimensjoner av glass kyvetten. To kilder (i rødt) holder glass-slide (beskrevet i figur 3). Denne holderen er deretter satt inne i glasset kyvetten. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5:... Prøveholder i observasjons sammenheng Embryos er immobilisert på objektglass i henhold til protokollen oppsummert i figur 3. Sleiden holdes av prøveholderen som er beskrevet i figur 4. Prøveholderen er satt inn i glass kyvetten, holdt av holderen som er beskrevet i figur 2.. Lyset arket er horisontal og illuminates embryoene fra siden. Påvisning objektivlinse er loddrett, over prøven. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Figur 6: Innspillingen av en C. elegans embryo uttrykker en histone :: GFP fusjon enkelt plan bilder av en transgen embryo uttrykker en histone :: GFP fusjon (zuIs178; stIs10024) ved ulike tidspunkt Bilder hentet fra en 3D-time-lapse-opptak:.. stabler laget av 20 skiver ( Avstanden mellom skiver 1 mikrometer); eksponeringstiden per skive: 30 msek; tidsintervall mellom stabler: 37 sek; total anskaffelses tid: 2 hr. Arrow: interphasic kjernen, pil hodet: kondensert mitotisk kromatin. Ved t = 0 min embryoet er ved 2-cellestadiet og ved t = 120 min embryoet inneholder rundt 70 celler som forventes under normale utviklings speed (merk at kun de celler som finnes i et enkelt plan som er synlige i bilder og ikke alle cellene i embryo). Kraften til belysning var 30 μW ved 488 nm (målt ved utkjørselen av belysningen objektiv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne videoen.</a> <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7: Innspillingen av en C. elegans embryo uttrykker en Tubulin :: GFP fusjon og en Histone :: mCherry fusjon. bilder hentet fra en 3D-time-lapse opptak av en C. elegans embryo uttrykker en Tubulin :: GFP fusjon (ruIs57) og en Histone :: mCherry fusjon (itIs37; stIs10226). Opptaksvilkår: oppkjøp av en bunke med 20 skiver (avstand mellom skiver 1mikrometer) hver 105 sek; total anskaffelses tid: 16 min; eksponeringstid: 200 msek for hver kanal. Panel A viser 10 skiver av samme stabel. Panel B viser den samme skive hvert 210 sek. Kraften til belysning var 30 μW og 300 μW, for 488 og 561 nm lasere, henholdsvis (målt ved utkjørselen av belysningen objektiv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne videoen.</a> <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8: Innspillingen av en C. elegans embryo uttrykker en VIT-2 :: GFP fusjon og en membran-målrettet mCherry. bilder hentet fra en 3D-time-lapse opptak av en C. elegans embryo uttrykker en VIT-2 :: GFP fusjon (PWIs23) og en membran-målrettet mCherry (ltIs44). Opptaksvilkår: oppkjøp av en bunke med 10 skiver (avstand mellom skiver 1 mikrometer) hver 30 sek; total anskaffelses tid: 25 min; eksponeringstid per kanal: 200 msek. Panel A viser de 5 første skiver av den samme stabel. Panel B viser samme skive hver 30sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne videoen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Sette opp et enkelt Lett Sheet mikroskop for<em&gt; I Toto</em&gt; Imaging av<em&gt; C. elegans</em&gt; Utvikling

Denne protokollen beskriver oppsettet av en lys ark mikroskop og gjennomføringen for in vivo avbildning av C. elegans embryoer.

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

En metode for dyrking Embryonic<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Målinger av fysiologiske stressresponser i C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Måling av RAN Peptid toksisitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...