Name: setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00
Duration: 8 min 37 s
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Agradecemos a todos os membros da Lenne e laboratórios Bertrand, em particular Olivier Blanc para desenvolvimento de software e Jérémie Capoulade para discussão. Agradecemos também a facilidade de imagem PICsL-IBDM, em particular Claude Moretti e Brice Detailleur para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subsídios Atip do CNRS (a P.-FL e VB), o Labex INFORMAR concessão (para P.-FL e VB) e uma bolsa da Sanofi-Aventis (para VB). Reconhecemos infraestrutura France-BioImaging apoiado pela Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, chamada &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Configuração da Folha de Luz eo Caminho de Detecção A Figura 1 apresenta um esquema geral da configuração óptica. <ol><li> Coloque e fixe o microscópio e os lasers na mesa óptica. </li><li> Combine lasers 488 nm, 561 nm e 405 nm, com os correspondentes espelhos dicróicas. Após os espelhos dicróicos, os lasers têm de ser precisamente co-alinhadas. Note-se que a escolha dos comprimentos de onda de laser, os espelhos dicróicos, filtros ópticos e é determinada a partir dos espectros de absorção dos marcadores fluorescentes específicos utilizados nas experiências. </li><li> Coloque o filtro sintonizável acústico-ótico (AOTF). Use a folha de teste fornecido pelo fornecedor para ajustar a frequência ea potência do AOTF. Quando bem alinhada, cerca de 90% da energia do laser é transmitido a um máximo de ajuste tal como medido por um powermeter. Note que alguns lasers pode ser totalmente controlado por software, o que poderia tornar o AOTF desnecessário. </li><li> Coloque e fixeo telescópio. Note-se que o telescópio é composta por duas lentes que ampliam o feixe com uma largura igual ou maior do que o diâmetro da abertura da parte de trás da lente objectiva iluminação. A lente com distância focal menor deve vir em primeiro lugar. </li><li> Lugar, alinhar e fixar o periscópio trazendo para cima do percurso óptico mais perto da abertura da parte de trás da lente cilíndrica. Note-se que os dois espelhos do periscópio são montados de uma forma que o seu eixo longo está colocando na inclinação do espelho para refletir o feixe totalmente expandida. </li><li> Coloque a lente cilíndrica próxima da saída de periscópio. Note-se que a lente cilíndrica focaliza o feixe em um sentido e deixa colimada na outra direção, formando assim uma folha de luz. </li><li> Recentrar a folha de luz resultante usando a lente objetiva iluminação. Note-se que o ponto focal imagem da objectiva de iluminação deve coincidir com o ponto focal do objecto o objectivo de detecção. Projeto do feixeem uma tela (por exemplo, uma parede) em uma longa distância. Mova o objetivo de iluminação ao longo do eixo do feixe de iluminação para obter na tela contornos nítidos da folha de luz. </li><li> Coloque a linha quad (405/488/561/638) filtro de emissão no lugar reservado no microscópio (cubo). </li><li> Coloque a câmara EMCCD na porta de saída do microscópio. </li><li> Fixar o primeiro estágio de translação manual sobre o palco de microscópio por meio de parafusos em furos na platina do microscópio. Note-se que a borda da plataforma de translação tem de ser posicionado a cerca de 2 cm de distância a partir do centro da platina do microscópio, de modo a que a tina é centrado por baixo da lente objectiva de detecção. </li><li> Fixar o segundo estágio de translação manual sobre o primeiro. As direções das duas etapas tem que ser perpendicular (X e Y traduções). </li><li> Fixar a fase Z piezoeléctrico no topo das duas fases anteriores. Note-se que uma plataforma motorizada pode ser utilizado em vez do estágio piezeléctrico. </li><li> Fixe o holde tinar (ver Figura 2), na parte superior das fases. A cuvete irá, assim, ser colocado na intersecção do caminho de iluminação e o caminho de detecção, que são perpendiculares um ao outro. </li></ol> 2. Verificar a folha de luz <ol><li> Encha uma tina de vidro com solução fluorescente, e colocá-lo no porta-amostras no cruzamento dos dois caminhos ópticos. A folha de luz é assim visível. Tem de ser horizontal, e simétrico / centrada em relação à lente objectiva de detecção. </li><li> Retirar a lente cilíndrica e adquirir uma imagem para medir a espessura da folha de luz. Note-se que a espessura da folha de luz depende da abertura numérica (AN) da iluminação da lente objectiva (cerca de 3-4 mm para NA = 0,3). Note-se que para uma dada lente, a espessura da folha, a luz pode ser aumentada reduzindo o tamanho do feixe de entrar na abertura traseira, com uma fenda. Note-se que as microesferas fluorescentes pode ser utilizado para medir o machadoial e resolução lateral do microscópio. </li><li> Volte a colocar a lente cilíndrica antes de iniciar o experimento. </li></ol> 3. A montagem de C. elegans Embriões Os passos seguintes são apresentados na Figura 3. <ol><li> Use uma caneta de marcação de diamante para cortar um pedaço de uma lâmina de vidro de 10 x 20 x 1 mm. </li><li> Prepare 5% bacto-agar na água, fervê-lo e mantê-lo em um bloco de aquecimento a 60 ° C. </li><li> Adicionar 50 ul de poli-L-lisina sobre um lado da peça de corte da lâmina, deixá-lo secar. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio no banco e corrigi-lo. </li><li> Justapor a peça de corte de lâmina com a lâmina fixa e adicionar uma gota de agar derretido no topo. Esprema o agar usando outra lâmina de microscópio limpa para obter um bloco de ágar fina. </li><li> Permitir que o bloco de ágar para secar antes de retirar o top slide. </li><li> Cortar a almofada de ágar sobre o lado da lâmina fixa, de modo a deixar um excesso de cerca de 3 mm of agar e remova cuidadosamente a lâmina fixa. </li><li> Adicionar 50 mL de poli-L-lisina sobre o agar e deixe secar completamente. </li><li> Coloque vermes grávidas em meio M9 em um vidro de relógio. </li><li> Cortar os vermes ao nível da vulva com um bisturi para libertar os embriões. </li><li> Sob um binóculo identificar os embriões na fase de interesse e recolhê-las usando uma pipeta microcapilar. </li><li> Colocar os embriões na parte do agar revestidos com poli-L-lisina, que se projecta a partir da peça de corte da lâmina. Coloque os embriões apenas junto à fronteira do slide. Não posicione os embriões na fronteira do agar, porque não vai ser estável o suficiente. Remover cuidadosamente o líquido, de modo que os embriões vai ficar sobre a camada de poli-L-lisina. </li><li> Alinhar rapidamente os embriões para evitar a dessecação. </li><li> Colocar a lâmina de corte em um prato de plástico Petri e adicione delicadamente meio M9 para cobrir o slide. </li><li> Verifique sob um binóculo que os ovos ainda estão presos no ágar. </li&gt; </ol> 4. Gravação de C. Desenvolvimento elegans <ol><li> Fixar a preparação anterior (corte deslizante, além de embriões de agar) no suporte de amostra e coloca-se numa cuvete. Figura 4 descreve o titular caseiro e A Figura 5 mostra uma vista da tina em contexto de observação. </li><li> Fixar a cuvete na fase piezoeléctrico. </li><li> Identificar a posição dos embriões com iluminação de campo brilhante. </li><li> Inicie o software feito em casa controlando a AOTF, a câmera eo estágio piezoelétrico. Note-se que um software livre, tal como micromanager, também pode ser utilizado. </li><li> Selecione a linha de laser e de energia (AOTF). </li><li> Ajustar a posição da folha de luz utilizando a fase três instruções de suporte da lente cilíndrica e a lente de iluminação. Mover o palco ao longo da direcção lateral (X) para obter o sinal mais brilhante. Ajustar então a posição Z da folha de luz, e a posição longitudinal (Y) para obter the melhor relação sinal-ruído. Note-se que a posição do foco folha de luz pode ter de ser ajustada a partir de um embrião de um outro para corrigir as diferenças de comprimento de caminho de luz. </li><li> Para adquirir imagens de lapso de tempo, selecione o tempo de exposição, o ganho, o tempo entre duas imagens, bem como o número de imagens a serem adquiridas, eo poder do laser. Para 2 aquisição de cores, selecione uma segunda linha de laser. Duas imagens coloridas são adquiridos de forma consecutiva. </li><li> Para adquirir pilha az, selecione também a distância entre as duas fatias, eo início e fim posições do piezoelétrico. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve uma configuração fácil de microscopia folha de luz para imagem in vivo de C. elegans embriões. Os elementos ópticos necessários para criar e alinhar a folha de luz, incluindo lasers, expansor de feixe, colimação e lentes de foco, pode ser facilmente montado em um banco óptico. Em combinação com um microscópio vertical para o caminho detecção ea câmera, este fornece uma solução simples de configurar uma folha de microscópio de luz. Essa geometria faz com que o ambiente de exemplo simples. O espécime vivo é colocado em uma cuba de vidro, que é realizada, posicionado e movido por um pequeno conjunto de peças mecânicas. Como microscopia iluminação folha é uma técnica de campo grande com capacidade de corte, apenas um único eixo motorizado movimento é necessário para imagens 3D. Isto limita o requisito de sincronização para um único elemento de varrimento e facilita o desenvolvimento do software. Comparado com ISPIM 6 nossa geomet verticalry permite o uso de elevados lente objectiva NA para detecção. Comparada com as configurações SPIM com lentes objectivas em relação ao plano horizontal da montagem da amostra e a imagem de uma série de embriões são mais fáceis. Ao todo, a implementação desta técnica é simples e pode ser alcançado com pouca experiência em ótica. Isto é uma alternativa mais barata a microscopia confocal, com as vantagens de uma maior velocidade e fototoxicidade reduzida, mas inconveniente de uma resolução axial inferior. Também desenvolvemos uma maneira fácil e reprodutível para montar C. embriões elegans para imagem in vivo utilizando este sistema. O procedimento de montagem é rápida (15 minutos) e é adequado para experiências diárias. Para C. elegans imagem, as vantagens desta configuração simples são pelo menos duas dobras: (i) em imagem toto é possível sem rotação e, portanto, a reconstrução 3D é simples; (Ii) a montagem da amostra é fácil e vários embriões podem ser visualizados sequencialmenteno mesmo slide. Nós mostramos exemplos de filmes de lapso de tempo com resolução temporal suficiente para observar as divisões celulares e alterações na forma celular. O poder de microscopia folha de luz para estudar C. desenvolvimento elegans também foi ilustrado recentemente por outros 6, 7, 8. Portanto, esta técnica vai ser muito útil para estudar a morfogénese e padronização da C. elegans embrião. Este sistema pode também ser utilizado para analisar o desenvolvimento de outros organismos modelo? É importante reconhecer que a implementação de microscopia de iluminação folha para pequenas e transparente organismo, como C. elegans é menos rigorosa do que para organismos maiores, como embriões de Drosophila. In toto imagens de Drosophila normalmente requer rotação e multi-view reconstruções 9, 10. Excitação de dois lados com lentes objetivas de excitação colineares também pode reduzir os efeitos de sombra causados ​​pela attenuatíon da luz 11. No entanto, a configuração aqui apresentada é ainda adaptado para a imagem de um lado dos embriões de Drosophila, com baixo branqueamento e baixo photoxicity. Esta configuração também pode ser útil para imagem pequenas e transparentes embriões como ascídias ou peixe-zebra.

A formação ea formação de um organismo envolve movimentos celulares, mudanças no formato da célula, divisão celular e diferenciação celular. Compreender a progressão e coordenação destes processos exigem ferramentas de imagem rápidos com capacidade de três dimensões e resolução subcelular. Entre as técnicas com estes em recursos de imagem in vivo, microscopia de iluminação luz folha também chamada microscopia de iluminação avião single / seletiva tem a vantagem única de produzir efeitos de baixa phototoxic e baixa fotodegradação 1,2. Em microscopia de iluminação da folha, a amostra é iluminada a partir do lado de uma folha de luz, o qual executa o corte óptico. O caminho de iluminação e o caminho de detecção são perpendiculares uns aos outros e a folha leve está alinhado de forma a coincidir com o objecto plano focal da lente objectiva de detecção. A amostra é colocada na intersecção dos dois caminhos, umnd pode ser movido ao longo do eixo para permitir a detecção de imagem 3D. Apenas o plano de interesse é iluminado e todos os pontos deste plano são detectados ao mesmo tempo. Isto aumenta significativamente a velocidade de aquisição e reduz a fotodegradação, bem como fototoxicidade em comparação com microscopia confocal 3. Praticamente, microscopia de iluminação folha é fácil de configurar e align: para dois imagem dimensional, sem varredura é necessário nem para a parte de detecção, nem para a parte de iluminação; como uma técnica de campo largo com capacidade de corte, a imagem tridimensional pode ser obtida através de um único movimento do eixo da fase, com a amostra. Aqui apresentamos a criação de um microscópio simples folha de luz e sua implementação no toto imagens de C. elegans embriões. C. elegans embriões são bem adaptados para viver in vivo imaging devido a sua transparência, linhagem invariante e estereotipada célula posiciona 4,5. A configuração da folha de luz desenvolvido baseia-se num microscópio vertical padrão para a detecção. O protocolo apresentado abaixo detalha como construir e alinhar o módulo de excitação / caminho, testar e caracterizar a folha de luz e montar a amostra para geração de imagens 3D. Ele também fornece exemplos de filmes time-lapse adquiridos com a configuração em várias cepas expressando marcadores fluorescentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Técnicas rápidas e baixas de imagem phototoxic são pré-requisito para estudar o desenvolvimento de organismos in toto. Microscopia folha de luz com base reduz foto-branqueamento e ação fototóxica em comparação com a microscopia confocal, proporcionando imagens em 3D com resolução subcelular. Aqui apresentamos a configuração de um microscópio folha base de luz, que é composto por um microscópio vertical e um pequeno conjunto de elementos opto-mecânico para a geração da folha de luz. O protocolo descreve como construir, alinhar o microscópio e caracterizar a folha de luz. Além disso, ele detalha como implementar o método no toto imagens de C. elegans embriões utilizando uma câmara de observação simples. O método permite a captura de 3D e duas cores filmes time-lapse mais algumas horas de desenvolvimento. Isso deve facilitar o rastreamento de forma da célula, as divisões celulares e proteínas marcadas por longos períodos de tempo.

Três experimentos de gravação de lapso de tempo 3D a partir de três diferentes C. elegans estirpes ilustrar o tipo de dados que podem ser obtidos usando a configuração do microscópio folha de luz descrita acima. Nós verificamos que, nestas condições, os embriões se desenvolvem em velocidade normal e sobreviver a imagem, de acordo com relatórios anteriores, indicando que a imagem SPIM provoca apenas baixos níveis de fototoxicidade em C. elegans embriões 6,7. A primeira linhagem expressa uma histona fundida a GFP (zuIs178; stIs10024). A gravação foi realizada durante 2 horas, com uma pilha de fatias 20 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 37 seg. Figura 6 ilustra um plano da pilha em diferentes pontos de tempo. Ambos os núcleos interphasic (seta) e cromatina condensada mitótico (cabeça de seta) são claramente visíveis. A segunda estirpe expressa um tubulina fundido a GFP (ruIs57) e uma histonafundido com mCherry (itIs37; stIs10226). A gravação foi realizada durante 16 min, com uma pilha de fatias 20 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 105 s. Figura 7 ilustra diferentes planos da pilha e diferentes pontos de tempo. O filme associado 1 apresenta reconstruções 3D em três momentos sucessivos. Durante a divisão, o fuso mitótico (verde) e cromossomos condensados ​​(vermelho) são claramente visíveis, permitindo o acompanhamento das orientações de divisão celular durante o desenvolvimento. A terceira estirpe expressa a apolipoproteína VIT-2 fundido a GFP (pwIs23) e uma membrana ligada mCherry (ltIs44). O registo foi feito durante 25 minutos, com uma pilha de fatias 10 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 30 seg. Figura 8 ilustra diferentes planos da pilha e diferentes pontos de tempo. Os movimentos rápidos das partículas de gema de lipoproteínas (verde) no interior das células podem ser facilmenteseguido. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: configuração óptica SPIM composto da iluminação e detecção de unidades, frente e vista para o fundo. Na unidade de iluminação, os lasers combinados pelos espelhos dicróicos entrar AOTF, o qual controla a potência de cada laser independentemente. Em seguida, o telescópio aumenta o tamanho do feixe por 4 vezes e a periscópio traz para a altura do microscópio. A lente cilíndrica forma a folha de luz, que é reorientada pelo objectivo iluminação. A unidade de detecção é integrado no microscópio vertical e é composta principalmente por a lente de detecção, o filtro, o tubo de lente e o EMCCD. A amostra é colocada na intersecção entre os caminhos de iluminação e detecção. A fase piezoeléctrico permite vertical (Z) deslocamentos de amostrapara a aquisição 3D. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2:. Titular Cuvette O portador consiste em três placas de alumínio e é enroscado sobre a fase piezoeléctrico. A cuba de vidro é realizado por uma mola (em vermelho). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: Montagem protocolo de C. elegans embriões para experiências SPIM. A peça cortada de vidro é revestido com poli-L-lisina. Uma almofada de ágar é posicionada sobre a superfície revestida. Poli-L-lisina Adiciona-se então para a almofada de ágar. Finalmente, C. elegans embriões são alinhados na almofada de ágar revestidos com poli-L-lisina. Figura 4: Exemplo de titular. O detentor encaixa às dimensões interiores da tina de vidro. Duas molas (em vermelho) manter a lâmina de vidro (descrito na Figura 3). Este suporte é então colocado dentro da tina de vidro. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5:... Suporte da amostra no contexto observação embriões são imobilizadas sobre a lâmina de vidro de acordo com o protocolo resumido na Figura 3 A corrediça é mantida pelo suporte de amostras descrito na Figura 4 O suporte de amostra é inserida na cuvete de vidro, detida pelo titular descrito na Figura 2. A folha de luz é horizontal e illuminates os embriões a partir do lado. A lente da objectiva de detecção esteja na vertical, por cima da amostra. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6: a gravação de um C. elegans embrião expressar uma fusão histona :: GFP imagens individuais de um embrião transgênico avião expressar uma histona :: fusão GFP (zuIs178; stIs10024) em momentos diferentes imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D:.. pilhas feitas de 20 fatias ( distância entre fatias de 1 mm); tempo de exposição por fatia: 30 ms; intervalo de tempo entre as pilhas: 37 seg; tempo de aquisição total: 2 horas. Arrow: núcleo interphasic, cabeça da seta: cromatina condensada mitótico. No instante t = 0 min, o embrião está na fase de 2 células-e a t = 120 min, o embrião contém cerca de 70 células como esperado sob s normais de desenvolvimentoxixi (notar que apenas as células contidas num mesmo plano são visíveis nas imagens e não todas as células do embrião). O poder de iluminação foi de 30 μW a 488 nm (medido na saída do objectivo de iluminação). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7: A gravação de um C. elegans embrião expressando um Tubulin :: fusão GFP e uma histona :: fusão mCherry. Imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D de um C. elegans embrião expressando um Tubulin :: fusão GFP (ruIs57) e um Histone :: fusão mCherry (itIs37; stIs10226). Condições de gravação: a aquisição de uma pilha de 20 fatias (distância entre fatias 1mm) a cada 105 seg; tempo de aquisição total: 16 min; tempo de exposição: 200 ms para cada canal. O painel A mostra 10 fatias da mesma pilha. O painel B mostra a mesma fatia cada 210 seg. O poder de iluminação foi de 30 μW e 300 μW, para 488 e 561 nm, respectivamente lasers (medido na saída do objectivo de iluminação). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8: a gravação de um C. elegans embrião expressando uma VIT-2 :: GFP Fusion e um alvo a membrana mCherry. Imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D de um C. elegans embrião expressando uma fusão VIT-2 :: GFP (PWIs23) e um mCherry direcionados à membrana (ltIs44). Condições de gravação: aquisição de uma pilha de 10 fatias (distância entre fatias 1 mícron) a cada 30 seg; tempo de aquisição total: 25 min; tempo de exposição por canal: 200 ms. O painel A mostra as 5 primeiras fatias da mesma pilha. O painel B mostra a mesma fatia cada 30seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a>

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Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Configurando um Microscópio folha de luz simples para<em&gt; Em Toto</em&gt; Imagem de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desenvolvimento

Este protocolo descreve a configuração de uma folha de microscópio de luz e sua implementação para imagem in vivo de C. elegans embriões.

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

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Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

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