Name: setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Vi tackar alla medlemmar i Lenne och Bertrand labb, särskilt Olivier Blanc för mjukvaruutveckling och Jérémie Capoulade för diskussion. Vi tackar också PICsL-IBDM imaging anläggning, särskilt Claude Moretti och Brice Detailleur för teknisk support. Detta arbete stöddes av ASPETS bidrag från CNRS (till P.-FL och VB), den Labex INFORM bidraget (till P.-FL och VB) och ett bidrag från Sanofi-Aventis (till VB). Vi erkänner France-BioImaging infrastruktur som stöds av Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, kallar &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Inställning av ljusBlad och Detection Path Figur 1 ger ett allmänt system av den optiska installationen. <ol><li> Placera och fixera mikroskop och lasrar på den optiska bordet. </li><li> Kombinera lasrar 488 nm, 561 nm och 405 nm med de motsvarande dikroiska speglar. Efter dikroiska speglar, lasrarna måste vara exakt co-linje. Observera att valet av de laservåglängder, dikroiska speglar och optiska filter bestäms från absorptionsspektra för de specifika fluorescerande markörer som används vid experimenten. </li><li> Placera akustisk-optiska avstämbara filter (AOTF). Använd testbladet som tillhandahålls av leverantören för att justera frekvensen och kraften i AOTF. När väl inriktade, är ungefär 90% av den lasereffekt som sänds vid en högsta tuning mätt med en powermeter. Observera att vissa lasrar helt kan kontrolleras av mjukvara, vilket skulle kunna göra AOTF onödigt. </li><li> Placera och fixerateleskopet. Observera att teleskopet består av två linser som expanderar strålen till en bredd som är lika med eller större än diametern för den bakre öppningen av belysningsobjektivlins. Objektivet med den minsta brännvidden bör komma först. </li><li> Placera, justera och fixera periskopet föra upp den optiska vägen närmare bakre öppningen av den cylindriska linsen. Notera att de två speglar av periskopet är monterade på ett sådant sätt att deras längdaxel är om på lutningen av spegeln i syfte att återspegla den fullt expanderade strålen. </li><li> Placera den cylindriska linsen bredvid periskopet exit. Notera att den cylindriska linsen fokuserar strålen i en riktning och lämnar den kollimeras i den andra riktningen, varigenom en ljus arket. </li><li> Lägga om den resulterande ljusarket med hjälp av belysning objektivlins. Observera att bilden fokus för belysningsmålet bör sammanfalla med föremålet fokus för detekteringsmålet. Project strålenpå en skärm (t.ex. en vägg) på långt avstånd. Flytta belysningsmålet längs belysningsstrålgången axeln för att få på skärmen skarpa konturer ljus arket. </li><li> Placera quad linjen (405/488/561/638) emissionsfilter på plats reserverad i mikroskop (kuben). </li><li> Placera EMCCD kamera för mikroskop utport. </li><li> Fäst den första manuella översättning skede på mikroskop scenen med skruvar i hål borrade i mikroskop scenen. Observera att kanten av den translationssteg måste placeras vid ca 2 cm från centrum av mikroskopets objektbord, så att kuvetten är centrerad under detektionsobjektivlins. </li><li> Fäst den andra manuell översättning steget på den första. Riktningarna för de två faser måste vara vinkelräta (X-och Y-översättningar). </li><li> Fäst Z piezoelektriska scenen högst upp i de två tidigare etapperna. Observera att en motoriserad skede kan användas i stället för det piezoelektriska skede. </li><li> Fäst kyvetten holder (se fig 2) i toppen av stegen. Kuvetten kommer således att placeras vid skärningen av belysningsvägen och detekteringsbana, som är vinkelräta mot varandra. </li></ol> 2. Kontroll av ljus Sheet <ol><li> Fyll ett glas kyvett med fluorescerande lösning, och placera den på provhållaren i skärningspunkten mellan de två optiska banor. Ljuset arket är således synlig. Det måste vara horisontell, och symmetrisk / centrerad med avseende på detekteringen objektivlins. </li><li> Ta bort den cylindriska linsen och förvärva en bild för att mäta tjockleken hos ljusarket. Observera att tjockleken av det ljus arket beror på den numeriska aperturen (NA) hos belysningsobjektivlins (ca 3-4 | im för NA = 0,3). Observera att för en given lins, kan man öka tjockleken hos det ljus arket genom att minska storleken av strålen som kommer in i bakre öppningen med en slits. Observera att fluorescerande mikrosfärer kan användas för att mäta yxaial och lateral upplösning på mikroskopet. </li><li> Sätt tillbaka den cylindriska linsen innan försöket. </li></ol> 3. Monteringen av C. elegans Embryon Följande steg är avbildade i figur 3. <ol><li> Använd en diamant-märkpenna för att skära en bit av en glasplatta av 10 x 20 x 1 mm. </li><li> Bered 5% Bacto-agar i vatten, koka den och hålla den i ett värmeblock vid 60 ° C. </li><li> Lägg till 50 l av poly-L-lysin på ena sidan av snittet bit slide, låt det torka. </li><li> Placera ett objektglas på bänken och fixa det. </li><li> Juxtapose snittet bit glida med den fasta bilden och lägga till en droppe av smält agar på toppen. Pressa agar ett rent objektglas för att få en tunn agar pad. </li><li> Låt agar pad torka innan du tar bort den översta bilden. </li><li> Skär agar plattan på sidan av den fixerade glidanordningen i syfte att lämna ett överskott av cirka 3 mm of agar och avlägsna försiktigt den fasta bilden. </li><li> Lägg till 50 mikroliter av poly-L-lysin på agar och låt den torka helt. </li><li> Sätt gravida maskar i M9-medium i ett urglas. </li><li> Skär maskarna vid nivån för vulva med en skalpell för att frigöra embryon. </li><li> Under en kikare identifiera embryon i det skede av intresse och samla dem med hjälp av en mikrokapillär pipett. </li><li> Placera embryon på den del av ägarn belades med poly-L-lysin som skjuter ut från den skurna bit av diabilden. Placera embryon precis intill gränsen till bilden. Placera inte embryona vid gränsen av agar, eftersom de inte kommer att vara stabil nog. Ta försiktigt vätskan så att embryona fastnar på poly-L-lysin lager. </li><li> Snabbt anpassa embryon för att undvika uttorkning. </li><li> Placera snittet glida i en plast petriskål och försiktigt lägga M9 medium för att täcka bilden. </li><li> Kolla under en kikare att äggen fortfarande sitter fast på agar. </li&gt; </ol> 4. Registrering av C. elegans Development <ol><li> Fäst föregående beredning (klipp slide, agar plus embryon) i provhållaren och placera det i en kyvett. Figur 4 beskriver hemlagad hållaren och Figur 5 visar en vy av kyvetten i observations sammanhang. </li><li> Fixa kyvetten på den piezoelektriska skede. </li><li> Identifiera placeringen av embryon med ljus fältbelysning. </li><li> Starta hemgjorda mjukvaran som styr AOTF, kameran och den piezoelektriska skede. Observera att en fri programvara, till exempel micromanager, också kan användas. </li><li> Markera laserlinjen och makt (AOTF). </li><li> Justera placeringen av ljus arket med hjälp av tre riktningar skede stödja den cylindriska linsen och belysningslinsen. Flytta bordet längs den laterala riktningen (X) för erhållande av den ljussignalen. Justera sedan Z-läget för ljus arket, och den längsgående läge (Y) för att erhålla ee bästa signal-brusförhållandet. Observera att placeringen av ljus arket fokus kan behöva justeras från ett embryo till en annan för att rätta till skillnaderna i ljus väglängd. </li><li> Att förvärva time-lapse bilder, välja exponeringstid, vinna, tiden mellan två bilder, samt hur många bilder som ska förvärvas, och lasereffekten. För 2 färg förvärv, välja ett andra laserlinje. Två färg bilder förvärvas i följd. </li><li> Att förvärva az stacken, även välja avståndet mellan de två skivor, samt början och slutet positioner av piezoelektriska. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Detta protokoll beskriver en enkel installation av ljus plåt mikroskop för in vivo avbildning av C. elegans embryon. De optiska element som är nödvändiga för att skapa och rikta ljuset ark, inklusive laser, beam expander, kollimering och fokuseringslinser, kan enkelt monteras på en optisk bänk. I kombination med en upprätt mikroskop för sökvägen detektering och kameran, ger detta en enkel lösning för att installera en ljus ark mikroskop. Denna geometri gör provmiljön enkel. Den levande prov placeras i en glaskuvett, som hålls och placerade och förflyttas av en liten uppsättning av mekaniska delar. Som ark belysning mikroskopi är ett brett fält teknik med sektioneförmåga, är bara en enda axel motoriserad rörelse som krävs för 3D-avbildning. Detta begränsar kravet på synkronisering till en enda svepelement och underlättar utveckling av mjukvara. Jämfört med ISPIM 6 vår upprätt GEOMETry tillåter användning av höga NA objektivlins för detektion. Jämfört med SPIM uppställningar med objektivlinser i horisontalplanet monteringen av provet och avbildning av en serie av embryon är lättare. Sammantaget är genomförandet av denna teknik enkelt och kan uppnås med lite expertis inom optik. Detta är ett billigare alternativ till konfokala mikroskop med fördelarna med en högre hastighet och minskad fototoxicitet, men nackdelen av en lägre axiell upplösning. Vi utvecklade också ett enkelt och reproducerbart sätt att montera C. elegans embryon för in vivo imaging med detta system. Monteringsförfarandet är snabb (15 min) och är lämplig för vardagliga experiment. För C. elegans bildbehandling, fördelarna med denna enkla inställning är minst två veck: (i) i sin helhet avbildning är möjlig utan rotation och därmed 3D rekonstruktion är enkel; (Ii) prov montering är enkel och flera embryon kan sekventiellt avbildaspå samma glas. Vi visade exempel på time-lapse filmer med tillräcklig tidsupplösning för att observera celldelningar och cellformförändringar. Kraften i ljus ark mikroskop för att studera C. elegans utveckling har också nyligen illustrerats av andra 6, 7, 8. Därför kommer denna teknik att vara mycket användbart för att studera morfogenes och mönstring av C. elegans embryo. Kan det här systemet även användas för att analysera utvecklingen av andra modellorganismer? Det är viktigt att inse att genomförandet av plåt belysning mikroskopi för små och genomskinliga organism, t.ex. C. elegans är mindre stränga än för större organismer såsom Drosophila embryon. I Toto avbildning av Drosophila kräver normalt rotation och multi-view rekonstruktioner 9, 10. Excite från två sidor med kolinjära excitation objektiv kan också minskas skuggeffekter som orsakas av attenuation av ljus 11. Ändå är inställnings presenteras här fortfarande anpassas till bilden en sida av Drosophila embryon med låg blekning och låg photoxicity. Denna inställning kan också vara till nytta för bild små och genomskinliga embryon såsom ascidians eller zebrafisk.

Bildningen och formning av en organism involverar cellrörelser, cellformförändringar, celldelning och celldifferentiering. Att förstå utvecklingen och samordningen av dessa processer kräver snabba bildframställning med tre dimensioner kapacitet och subcellulär upplösning. Bland de tekniker med dessa in vivo bildfunktioner, ljus blad belysning mikroskopi kallas även singel / selektiv plan belysning mikroskopi har den unika fördelen att producera låg-fototoxisk effekt och låg-fotoblekning 1,2. I ark belysning mikroskopi provet belyses från sidan med en lätt blad, som utför den optiska sektionering. Belysningen bana och detekteringsbanan är vinkelräta mot varandra och ljuset arket är inriktad att sammanfalla med det objekt fokalplan detekteringen objektivlins. Provet placeras i skärningspunkten mellan de två vägar, ennd kan förflyttas längs detekteringsaxeln för att medge 3D-avbildning. Endast planet för intresse är upplyst och alla punkter av detta plan detekteras samtidigt. Detta ökar avsevärt förvärvshastighet och minskar fotoblekning och fototoxicitet jämfört med konfokalmikroskopi 3. Praktiskt, är blad belysning mikroskopi lätt att installera och align: för två dimensionell avbildning, är nödvändigt vare sig för den delen detektering, och inte heller för belysning delen ingen scanning; som ett brett fält teknik med sektione kapacitet, kan tre-dimensionell avbildning erhållas genom en enda axelrörelse av scenen som håller provet. Här presenterar vi inrättandet av en enkel ljus ark mikroskop och dess genomförande i sin helhet avbildning av C. elegans embryon. C. elegans embryon är väl lämpade att leva i vivo imaging på grund av sin öppenhet, invariant härstamning och stereotypa cell placerar 4,5. Den utvecklade ljusinställningsblad är baserat på en standard upprätt mikroskop för att upptäcka. Protokollet presenteras nedan beskriver hur man bygger och rikta exciteringsmodulen / sökväg, provning och karakterisera ljus plåt och montera provet för 3D-avbildning. Det ger också exempel på tidsförlopp filmer som förvärvats med installationen på olika stammar som uttrycker fluorescerande markörer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Snabba och låga fototoxiska avbildningstekniker är förutsättning för att studera utvecklingen av organismer i sin helhet. Ljus ark baserade mikroskopi minskar fotoblekning och fototoxiska effekter jämfört med konfokalmikroskopi, samtidigt som 3D-bilder med subcellulär upplösning. Här presenterar vi över konfigurationen av en ljus ark baserat mikroskop, som består av en upprättstående mikroskop och en liten uppsättning av opto-mekaniska element för alstring av ljusarket. Protokollet beskriver hur man bygger, rikta mikroskopet och karakterisera ljus arket. Vidare detaljer det hur man skall genomföra metoden i sin helhet avbildning av C. elegans embryon med hjälp av en enkel observation kammare. Metoden gör det möjligt att fånga 3D två färger time-lapse filmer under några timmar av utveckling. Detta bör underlätta spårning av cellform, celldelningar och märkta proteiner under långa tidsperioder.

Tre 3D-time-lapse inspelning experiment från tre olika C. elegans stammar visar vilken typ av data som kan erhållas med hjälp av ljus arket mikroskop inställning som beskrivs ovan. Vi kontrollerade att under dessa förhållanden embryona utvecklas i normal hastighet och överleva avbildning, i linje med tidigare rapporter om att SPIM avbildning orsakar bara låg fototoxicitet nivåer i C. elegans embryon 6,7. Den första stammen uttrycker en histon smält till GFP (zuIs178; stIs10024). Inspelningen utfördes under 2 timmar med en stapel av 20 skivor (avstånd mellan skivorna 1 mikrometer) tas varje 37 sek. Figur 6 illustrerar en plan av stapeln vid olika tidpunkter. Båda interphasic kärnor (pil) och kondenserad mitotiska kromatin (pilspets) syns tydligt. Den andra stammen uttrycker en tubulin smält till GFP (ruIs57) och en histonsmält till mCherry (itIs37; stIs10226). Inspelningen utfördes under 16 min med en stapel av 20 skivor (avstånd mellan skivorna 1 mikrometer) tas varje 105 sek. Figur 7 illustrerar olika plan i stapeln och olika tidpunkter. Den tillhörande film 1 visar 3D rekonstruktioner vid tre på varandra följande tidpunkter. Under division, den mitotiska spindeln (grön) och kondenserade kromosomer (röd) syns tydligt vilket gör att spårning av celldelning riktlinjer under utveckling. Den tredje stammen uttrycker apolipoprotein VIT-2 fuserat till GFP (pwIs23) och ett membranbundet mCherry (ltIs44). Inspelningen utfördes under 25 min med en stapel av 10 skivor (avstånd mellan skivorna 1 mikrometer) tas varje 30 sek. Figur 8 illustrerar olika plan i stapeln och olika tidpunkter. De snabba rörelser av äggula lipoproteinpartiklar (gröna) i cellerna kan lättföljde. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1: SPIM optisk installation bestående av belysning och detekteringsenheter, front och botten vyer. I belysningsenheten, lasrarna kombineras av dikroiska speglar in i AOTF-filtret, som styr effekten för varje laser självständigt. Därefter ökar teleskopet storleken hos strålen av 4-faldigt och periskopet tar den till höjden av mikroskopet. Den cylindriska linsen bildar ljuset ark, som är en ny inriktning av belysnings mål. Detekteringsenheten är inbyggd i den upprättstående mikroskop och består huvudsakligen av detekterings lins, filter, röret linsen och EMCCD. Provet är placerat vid skärningspunkten mellan belysnings-och detekteringsvägar. En piezoelektrisk skede tillåter vertikala (Z) förskjutningar av provetför 3D-förvärvet. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2:. Kyvetthållare Hållaren består av tre aluminiumplåtar och är skruvad på det piezoelektriska skede. Den glaskuvett innehas av en fjäder (i rött). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Bild 3: Montering protokoll av C. elegans embryon för spim experiment. Ett snitt glasbit är belagd med poly-L-lysin. En dyna av agar är placerad på den belagda ytan. Poly-L-lysin tillsätts sedan på agar pad. Slutligen C. elegans embryon är inriktade på poly-L-lysin belagda agar pad. Figur 4: En provhållare. Hållaren passar till innermåtten på glas kyvetten. Två fjädrar (i rött) håller glasskiva (beskrivs i figur 3). Hållaren placeras sedan inuti glaset kyvett. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5:... Provhållare i observations sammanhang Embryon är immobiliserade på glasskiva enligt protokollet sammanfattas i Figur 3 Bilden hålls av provhållaren som beskrivs i Figur 4 Provhållaren sätts in i glas kyvetten, hålles av hållaren som beskrivs i figur 2. Ljuset arket är horisontell och illuminates embryona från sidan. Upptäckten objektivet är vertikal, ovanför provet. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Figur 6: Inspelning av ett C. elegans embryo som uttrycker en histone :: GFP fusion enda plan bilder av ett transgent embryo som uttrycker en histone :: GFP fusion (zuIs178, stIs10024) vid olika tidpunkter Bilder som extraherats från en 3D-time-lapse inspelning:.. stackar gjorda av 20 skivor ( Avståndet mellan skivorna 1 mikrometer); exponeringstid per slice: 30 ms; tidsintervall mellan högar: 37 sek; total förvärvs tid: 2 tim. Arrow: interphasic kärna, pilspets: kondenserad mitotiska kromatin. Vid t = 0 min embryot är i 2-cellstadiet och vid t = 120 min embryot innehåller cirka 70 celler som förväntat under normala utvecklings speed (notera att endast de celler som ingår i ett enda plan är synliga på bilderna och inte alla celler i embryot). Kraften i belysning var 30 ^ W vid 488 nm (mätt vid utloppet av belysningsmålet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Klicka här för att se filmen.</a> <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7: Inspelning av ett C. elegans embryo som uttrycker en tubulin :: GFP fusion och en Histon :: mCherry fusion. Bilder som extraherats från en 3D-time-lapse inspelning av ett C. elegans embryo som uttrycker en tubulin :: GFP fusion (ruIs57) och en Histon :: mCherry fusion (itIs37, stIs10226). Inspelningsförhållanden: förvärv av en bunt med 20 skivor (avstånd mellan skivor 1im) var 105 sek; total förvärvs tid: 16 min; Exponeringstid: 200 ms för varje kanal. Panel A visar 10 skivor av samma bunt. Panel B visar samma skiva varje 210 sek. Kraften i belysning var 30 ^ W och 300 ^ W, för 488 och 561 nm lasrar, respektive (mätt vid utloppet av belysningsmålet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Klicka här för att se filmen.</a> <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8: Inspelning av ett C. elegans embryo som uttrycker en VIT-2 :: GFP fusion och en membran riktade mCherry. Bilder som extraherats från en 3D-time-lapse inspelning av ett C. elegans embryo som uttrycker en VIT-2 :: GFP fusion (PWIs23) och ett membran-riktad mCherry (ltIs44). Inspelningsförhållanden: förvärv av en bunt med 10 skivor (avstånd mellan skivorna 1 mikrometer) var 30 sek; total förvärvs tid: 25 min; exponeringstid per kanal: 200 msek. Panel a visar de fem första skivor av samma stack. Panel B visar samma skiva varje 30 sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Klicka här för att se filmen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Ställa in en enkel ljus Sheet Mikroskop för<em&gt; I Toto</em&gt; Imaging av<em&gt; C. elegans</em&gt; Utveckling

Detta protokoll beskriver installationen av en ljus ark mikroskop och dess genomförande för in vivo avbildning av C. elegans embryon.

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Major Components of the Light Microscope

Viktigaste komponenterna i ljusmikroskop

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryon med en Epifluorescent Mikroskop och Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

En metod för odling av embryonala<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Mätningar av fysiologiska stressreaktioner i C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Mätning ran peptid toxicitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...