Name: an assay for lateral line regeneration in adult zebrafish
Uploaded: 2014-04-08T19:00:00
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The authors have nothing to disclose.

Tutte le procedure vengono eseguite seguendo le linee guida descritte in &quot;Principi di cura degli animali da laboratorio&quot; (National Institutes of pubblicazione della Sanità n. 85-23, riveduta 1985) e il protocollo di animali Rosalind Franklin dell&#39;Università Institutional Animal Care ed uso commissione ha approvato 08-19. 1. Gentamicina-induzione di capelli necrosi cellulare <ol><li> Preparare gentamicina solfato in soluzione fisiologica ad una concentrazione finale di 0,004...

<ol>
	<li>Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Line+of+Zebrafish:+a+Model+System+for+the+Analysis+of+Morphogenesis+and+Neural+Development+in+Vertebrates.">The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates.</a> Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).</li><li>Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+Processing+of+Water+Currents+by+Fishes.">Sensory Processing of Water Currents by Fishes.</a> Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).</li><li>Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ototoxin-Induced+Cellular+Damage+in+Neuromasts+Disrupts+Lateral+Line+Function+in+Larval+Zebrafish.">Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish.</a> Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).</li><li>Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Stimuli+and+the+Fish+Lateral+Line.">Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line.</a> Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).</li><li>Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Larvae+Exhibit+Rheotaxis+and+Can+Escape+a+Continuous+Suction+Source+Using+Their+Lateral+Line.">Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line.</a> PloS One. 7 (5), e36661 (2012).</li><li>Raible, D. W., Kruse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Lateral+Line+System+in+Embryonic+Zebrafish.">Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).</li><li>Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).</li><li>Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).</li><li>Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+Signaling+Regulates+the+Extent+of+Hair+Cell+Regeneration+in+the+Zebrafish+Lateral+Line).">Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line).</a> J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).</li><li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feathers+and+Fins:+Non-Mammalian+Models+for+Hair+Cell+Regeneration.">Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration.</a> Brain Res. 1277, 12-23 (2009).</li><li>Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. 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Neurosci. 11, (2010).</li><li>Mathur, P., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+As+a+Model+to+Understand+Mechanisms+of+Addiction+and.">Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and.</a> Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).</li><li>Ignatius, M. S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+As+a+Model+for+Cancer+Self-Renewal.">Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal.</a> Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).</li><li>Milan, D. J., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Genetic+Models+for+Arrhythmia.">Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).</li><li>Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentamicin+Is+Ototoxic+to+All+Hair+Cells+in+the+Fish+Lateral+Line+System.">Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System.</a> Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).</li><li>Littleton, R. M., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+Nontraditional+Model+of+Traditional+Medicine.">Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine.</a> J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).</li><li>Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).</li><li>Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Larvae+Exhibit+Rheotaxis+and+Can+Escape+a+Continuous+Suction+Source+Using+Their+Lateral+Line).">Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line).</a> PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).</li><li>Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stat3/Socs3a+Pathway+Is+a+Key+Regulator+of+Hair+Cell+Regeneration+in+Zebrafish+[Corrected.">The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected.</a> J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).</li><li>Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Dye+Staining+of+Neuromasts+in+Live+Fishes:+An+Aid+to+Systematic+Studies.">Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies.</a> Ichthyol Res. , 286-290 (2012).</li><li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Probes+That+Stain+Living+Nerve+Terminals.">Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals.</a> The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).</li><li>Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Mechanosensory+Hair+Cells+of+the+Zebrafish+Lateral+Line+to+Aminoglycosides+Reveals+Distinct+Cell+Death+Pathways.">Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways.</a> Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).</li><li>Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).</li><li>Herrera, A. A., Banner, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+and+Effects+of+Vital+Fluorescent+Dyes:+Observation+of+Motor+Nerve+Terminals+and+Satellite+Cells+in+Living+Frog+Muscles.">The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles.</a> J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).</li><li>Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass, ., L, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Imaging+of+Vegetative+Hyphal+Fusion+in+Neurospora+Crassa.">Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa.</a> Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).</li><li>Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+Regeneration+Is+Impaired+in+an+Adult+Zebrafish+Model+of+Diabetes+Mellitus.">Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus.</a> Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).</li><li>Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+Transmission+of+Diabetic+Metabolic+Memory+in+Zebrafish+Correlates+With+DNA+Hypomethylation+and+Aberrant+Gene+Expression.">Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression.</a> Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).</li></ol>

Basato sulla vasta letteratura che è stato stabilito per l&#39;analisi della linea laterale (LL) rigenerazione embrionale e larvale zebrafish 8,24,25, l&#39;obiettivo del nostro studio è stato quello di sviluppare un test quantitativo per la linea rigenerazione laterale in zebrafish che potrebbe essere applicato a modelli di malattia che sono meglio studiati nei pesci adulti. Abbiamo scoperto che alcuni punti critici sono importanti quando si applicano le procedure sviluppate per embrionale pesce / larvale ...

Il sistema (LL) linea laterale è un organo mechanosensory trovato in entrambi i pesci e anfibi che è responsabile per l&#39;udito, l&#39;equilibrio, rheotaxis e comportamenti di mediazione, come la scuola e il predatore evasione 1-5. Si compone di gruppi di cellule capelli circondate da cellule di supporto, entrambi i quali sono disposti in strutture chiamate neuromasti 6. Questi neuromasti sono tipicamente organizzati in linee verticali (chiamato punti) lungo l&#39;asse longitudinale del corpo e la coda con alcuni punti orizzontali osservati nella testa del pesce. Nell&#39;adulto, neuromasti sono significativamente più numerosi nei punti rispetto ai pesci embrionale o larvale 6. Studi biomedici in zebrafish si sono concentrati sugli effetti del trattamento antibiotico, trauma indotta dal rumore, infezione cronica, ecc. su cellule ciliate 7,8 nel tentativo di capire meglio i loro effetti sugli esseri umani. Diversamente dalla maggior parte dei vertebrati, TEleosts, come il pesce zebra (Danio rerio), hanno la capacità di rigenerare le cellule dei capelli perduti. Zebrafish sono particolarmente utili perché del loro tempo rapido sviluppo e ad alta capacità rigenerativa. Ad oggi, tuttavia, studi sullo sviluppo di zebrafish linea laterale e / o rigenerazione sono principalmente utilizzati il pesce stadio embrionale e larvale causa del numero ridotto di neuromasti linea laterale che agevola conteggio e analisi 6,9,10. Tuttavia, come molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche 11-16 sono studiate nei pesci adulti e non le larve, ci siamo concentrati sullo sviluppo di un test rigenerativa linea laterale in zebrafish adulto con gentamicina (un aminoglicoside precedentemente utilizzato in larve di zebrafish e più recentemente utilizzato con pesci adulti 17) in modo che un saggio era disponibile che potrebbe essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto attuali. Mentre in precedenza pubblicati procedure di Van Trump et al. 17 ha stabilito le condizioni per l&#39;ablazione delle cellule dei capelli nel pesce adulto, che non hanno stabilito una curva standard per la rigenerazione neuromast che è necessario per il confronto quantitativo tra controllo e gruppi sperimentali come quando si utilizzano linee di zebrafish transgenici o stati di malattia farmacologicamente indotti in zebrafish 18. Abbiamo quindi seguito le procedure di Van Trump et al. 17 per l&#39;ablazione delle cellule dei capelli, ma costruito sul loro lavoro per stabilire una curva standard di rigenerazione neuromast per consentire ai ricercatori di utilizzare i nostri dati quando si confrontano controllo e gruppi sperimentali come ad esempio con modelli di malattia di zebrafish adulto . Il dosaggio è stato inoltre progettato per consentire estensione dell&#39;analisi alla cella capelli individuo quando è richiesto un livello di risoluzione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="431">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate solution (50mg/ml)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Phenoxyethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D-3418</td>
			<td>485 nm excitation &#955; and 603 nm emission &#955;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Mid Sci</td>
			<td>TP92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>Matek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting&#160; Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMZ-1500</td>
			<td>Any dissecting microscope is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera for Imaging</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Q imaging</td>
			<td>Any camera is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>NIH Image</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Any imaging software is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i</td>
			<td>Any high resolution fluorescent microscope is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatic System</td>
			<td>&#160;KG Aquatics ZFS Rack System.</td>
			<td></td>
			<td>Any aquatic system can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for lateral line regeneration in adult zebrafish

Data l&#39;importanza clinica dell&#39;udito e disturbi dell&#39;equilibrio nell&#39;uomo, organismi modello come zebrafish sono stati utilizzati per studiare lo sviluppo linea laterale e rigenerazione. Il zebrafish è particolarmente attraente per tali studi a causa del suo tempo di sviluppo rapido e la sua elevata capacità rigenerativa. Ad oggi, gli studi di zebrafish della linea di rigenerazione laterali sono principalmente utilizzati pesci delle fasi embrionali e larvali a causa del numero inferiore di neuromasti in queste fasi. Ciò ha reso analisi quantitativa della linea rigenerazione e / o sviluppo più semplice negli stadi precoci di sviluppo laterale. Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti e non nell&#39;embrione / larve, ci siamo concentrati sullo sviluppo di un laterale dosaggio linea rigenerativa quantitativa in zebrafish adulto in modo che un test era disponibile che potrebbe essere applicato a corrente modelli di malattia di zebrafish adulto. Basandosi su studi precedenti di Van Trump et al. 17 che descrive le procedure per l&#39;ablazione delle cellule ciliate adulto messicano pesci ciechi grotta e zebrafish (Danio rerio), il nostro test è stato progettato per permettere il confronto quantitativo fra controllo e gruppi sperimentali. Ciò è stato realizzato attraverso lo sviluppo di una curva standard neuromast rigenerativa basata sulla percentuale di ricomparsa neuromast su un periodo di tempo di 24 ore seguente gentamicina indotta necrosi delle cellule ciliate in una regione definita della linea laterale. Il dosaggio è stato inoltre progettato per consentire estensione dell&#39;analisi a livello di cella capelli individuo quando è richiesto un livello di risoluzione.

Ottimizzazione delle procedure per quantificare la rigenerazione neuromast della linea laterale in zebrafish adulto. Le neuromasti di zebrafish larvale sono facilmente quantificabili; Tuttavia, la linea laterale del zebrafish adulto ha un numero molto maggiore di neuromasti per punto effettuare analisi quantitative più difficile 6,17,19,20. Come si vede nella Figura 1A, la testa ha un numero significativamente maggiore di neuromasti rispetto sia ...

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An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti piuttosto che l&#39;embrione / larve, abbiamo sviluppato una linea laterale rigenerativo dosaggio quantitativo che può essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto. Il saggio coinvolto risoluzione al neuromast 1) e 2) livelli di cellule singolo capello.

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