Name: detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry
Uploaded: 2014-03-28T15:00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia. Forfatterne vil gerne anerkende Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Tyskland) til sponsorering af dette manuskript, Dr. Paolo Petrucciani (Department of Immuno-hæmatologi og Transfusion Service Hospital Lotti Pontedera, Pisa, Italien) til at tilvejebringe humane buffy coats og Prof. Massimo Pasqualetti (Biologisk Institut - Enhed for Cellulær og Developmental Biology, University of Pisa, Pisa, Italien) for boliger musen koloni.

Etiske retningslinjer Mennesker og dyr prøver blev behandlet efter retningslinjerne i det italienske sundhedsministerium, loven 116/92 og Det Europæiske Fællesskaber Rådets direktiv 86/609/EØF. 1.. Monocyt Cellekulturer <ol><li> Kultur humane THP-1-celler i T-75 kolber indeholdende RPMI-1640-medium suppleret med 10% humant serum, 50 U / ml penicillin og 50 mg / ml streptomycin, 0,05 mM β-mercaptoethanol ved 37 ° C i 5% CO 2. </li><li> Split kulturer når sammenflydende (hver 3-5 dage). </li></ol> 2. Isolering af perifere mononukleære blodceller (PBMC&#39;er) fra Buffy Coats <ol><li> Før start af isolation protokol forberede en opløsning af phosphatpufret saltvand (PBS), pH 7,2, 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,5% bovint serumalbumin (BSA), tilsætning af 5 ml BSA stamopløsning til 95 ml skyllepuffer (1: 20 fortynding). Afgasse bufferen og holde det koldt (2-8° C). VIGTIGT: Hvis afgasse bufferen kan resultere i mindre end optimale resultater, fordi bobler kan blokere isolation kolonne (se trin 3.2). Bemærk: Antikoagulant citratdextrose formlen-A (ACD-A) eller citrat phosphat dextrose (CPD), kan alternativt anvendes. Omvendt kan andre albumin proteiner eller sera fra andre arter erstatte BSA. Brug ikke buffere indeholdende Ca 2 + eller Mg 2 +. </li><li> Opnå buffy coats fra raske donorer (i alderen 20-60 år). </li><li> Forbered 50 ml koniske rør til densitetsgradientcentrifugering. Bestem antallet af rør, der kræves for behandling af blod (hvert rør kan behandle 35 ml fortyndet blod), og der tilsættes 15 ml Ficoll-Paque til hver tomme rør. </li><li> Fortynd 8 ml blod med 24 ml PBS / BSA / EDTA-opløsning (1:04 fortynding). </li><li> Forsigtigt lag den fortyndede opløsning oven på Ficoll-Paque (densitet = 1,077 g / ml) i hvert af de 50 ml koniske rør. Bland ikkeblod og Ficoll-Paque. VIGTIGT: For at undgå at blande blod og Ficoll-Paque, holde røret i en 45 ° vinkel og lag blod blanding langsomt. </li><li> Centrifuger ved 400 x g i 30 min ved 4 ° C. Mononukleære celler (multinationale selskaber), vil forblive på plasma-Ficoll-Paque interface, hvorimod granulocytter og erythrocytter sediment som følge af højere tæthed ved det osmotiske tryk af Ficoll-Paque. </li><li> Overfør interfaseceller (perifert blod mononukleære celler, PBMC&#39;er) til et nyt 50 ml rør fyldt med PBS / BSA / EDTA og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. </li><li> Vask pellet to gange med PBS / BSA / EDTA til fjernelse af blodplader. Spin ved 200 xg i 10 minutter ved 4 ° C. </li><li> Kultur cellerne i komplet RPMI-1640 med 10% humant serum og antibiotika, eller fortsæt til monocytter rensning. </li></ol> 3. Oprensning af primær Monocytter fra PBMC&#39;er <ol><li> Isoler monocytter fra PBMC&#39;er ved magnetisk perle separation under anvendelse Humen Pan monocyt isolationskit: <ol><li> Pass celler gennem en 30 um Nylon mesh (preseparation filtre, 30 um) for at fjerne eventuelle celleklumper. </li><li> Bestem celle nummer ved hjælp af et hæmocytometer. </li><li> Centrifugeres cellesuspensionen ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur (RT). Aspirer supernatanten fuldstændigt. </li><li> Resuspender cellepelleten i 30 pi PBS / EDTA / BSA-buffer pr 10 7 totale celler. </li><li> Der tilsættes 10 pi FcR blokeringsreagens per 10 7 totale celler. </li><li> Der tilsættes 10 ul af biotin-Antibody Cocktail pr 10 7 totale celler. </li><li> Bland godt og inkuberes i 5 minutter ved 2-8 ° C. </li><li> Tilsæt 30 gl buffer per 10 7 totale celler. </li><li> Tilsæt 20 ul anti-biotin mikroperler pr 10 7. totale celler. </li><li> Bland godt og inkuberes i 10 minutter ved 2-8 ° C. </li><li> Resuspender op til 10 8 celler i 500 pi PBS / EDTA / BSA-buffer. </li></ol></li><li> Magnetisk separation <ol><li> Derfor til det samlede celle nummer, vælge en passende MACS Column og MACS Separator (se MACS Kolonne datablad). </li><li> Kolonnen anbringes i magnetfeltet af MACS Separator. </li><li> Forbered kolonne ved skylning med den passende mængde af PBS / EDTA / BSA-buffer (MS kolonner: 500 pi; LS kolonner: 3 ml). Bemærk: Kolonner er &quot;flow stop&quot; og ikke løber tør. </li><li> Anvend cellesuspension på søjlen. Saml gennemstrømning indeholder umærkede celler, der repræsenterer den berigede monocyt fraktion. </li><li> Vask kolonne 3x med PBS / EDTA / BSA-buffer (500 pi for MS og 3 ml for LS per vask). </li><li> Saml umærkede celler, der passerer igennem, repræsenterer de berigede monocytceller, og føje til gennemstrømning fra afsnit 3.2.4. Bemærk: Vask søjlen ved tilsætning af PBS / EDTA / BSA buffer portioner kun, når søjlen reservoiret er tom. </li><li> (Valgfri) Fjern kolonnen fraseparator og placere den på en egnet samling rør. Pipette puffer på søjlen (MS kolonner: 1 ml; LS kolonner: 5 ml). Skyl straks de magnetisk mærkede nonmonocyte celler ved fast skubbe stemplet ind i kolonnen. </li><li> Kultur oprenset monocytter i komplet RPMI-1640 med 10% humant serum og antibiotika. </li></ol></li></ol> 4.. Oprensning af Primary Monocyter fra fuldblod <ol><li> Oprense monocytter fra fuldblod under anvendelse af fuldblod monocyt isolation kit ifølge producentens anvisninger. </li></ol> 5.. Nanopartikel Internalisering i blodleukocytter og renset Monocyter <ol><li> Plate 5 x 10 5 celler / ml (1 ml / brønd) i de isolerede PBMC&#39;er eller oprensede CD14 positive monocytter i en 12-brønds plade. </li><li> Vortex FITC-SiO 2 nanopartikel stamopløsning og resuspender i komplet medium til en fungerende koncentration på 100 nM. </li><li> Tilsæt 10 ul af arbejde nanopartiklen suspension (100 nM) til behandlede prøver at nå en nanopartikel slutkoncentration på 1 nM. Tilsæt samme mængde af komplet medium i ubehandlede kontroller til hver brønd. </li><li> Efter 1 time internalisering indsamle prøver i et 1,5 ml polypropylenrør og centrifugere dem i 3 minutter ved 6.000 x g ved stuetemperatur. </li><li> Vask pelleten med 1 ml løbebuffer 3 min ved 6000 xg ved stuetemperatur. </li><li> Pellet resuspenderes i 200 pi løbebuffer. Cellerne er nu klar til læsning ved flowcytometri. </li></ol> 6.. Isolering af Primære Blandet Glia kulturer (se Bertero et al. 7) 7.. Genudpladning en blandet glial Confluent Celledyrkning <ol><li> Vask en T-75 kolbe én gang med 10 ml PBS (w / o Ca2 + / Mg2 +), hvorefter der tilsættes 10 ml Versene og inkuber ved 37 ° C i 5-7 min. </li><li> Pipette supernatanten op og ned flere gange for at løsne cellerne fra T-75 overflade og opløsercelleaggregater. </li><li> Overfør cellesuspensionen i et 15 ml polypropylenrør. Saml en lille mængde cellesuspension at tælle celler med en hæmocytometer. </li><li> Centrifugeres cellesuspensionen i 5 minutter ved 300 xg ved stuetemperatur. </li><li> Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i en slutkoncentration på 5 x 10 5 celler / ml i glial komplet dyrkningsmedium. </li><li> Plate 0,5 ml / brønd i en 24-brønds plade og lade cellerne nøjes med 2-4 timer før nanopartikel behandling. </li></ol> 8.. Nanopartikel Internalisering i Mikroglia <ol><li> Tilsæt 500 pi af komplet glial dyrkningsmedium (for ubehandlede kontroller) eller 500 pi af en 2x rhodamin-SiO2 nanopartikel suspension i fuldstændig glial dyrkningsmedium (for behandlede prøver) til hver brønd. </li><li> Pipette cellerne til at tillade udstationering af nonrapid-vedhængende celler ved de valgte tidspunkter og samle dem i 2 ml polypropylen rør. </li><li> Tilføj 500 piaf Versene til hver brønd og inkubere pladen ved 37 ° C i 5 min, og derefter frigøre den resterende cellefraktion og indsamle hver prøve med de tilsvarende nonadhering celler i det foregående trin. </li><li> Centrifuger prøverne i 3 min ved 300 xg ved RT. </li><li> Resuspender pellet i 100 ul AutoMACS Running buffer. </li></ol> 9.. Farvning med CD11-VioBlue <ol><li> Der tilsættes 10 pi VioBlue-CD11 humant / muse-antistof til 100 ul cellesuspension (1:11 forhold) i rindende puffer og inkuberes 10 minutter ved 4 ° C. </li><li> Tilsæt 1 ml løbebuffer og blandes cellesuspension. </li><li> Centrifuger hver prøve i 3 min ved 300 x g.. </li><li> Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 100-150 pi løbebuffer. </li><li> Læs prøver cytometret (opbevare prøverne ved 4 ° C mellem de to sidste trin). VIGTIGT: før analysere prøverne, gå til kompensation af overlappende signaler in emissionsspektre observeret mellem forskellige fluorochromer (fluorokromkonjugerede nanopartikler eller antistoffer). </li></ol> 10.. Spectral afsmittende Compensation <ol><li> Åbn &quot;Indstillinger Instrument&quot; boks (til stede i alle de instrument programmer). Bemærk: Hvis du bruger et andet instrument fra den ene rapporteret i Material tabel, henvises til instrumentet specifikke manual for detaljerne erhvervelsesomkostninger. </li><li> Anskaf ubehandlet prøve (uden nanopartikler) ved lav fluidisk hastighed (hvis det tillades af instrument). Under købet manuelt justere frem og side lysspredning (FSC og SSC, henholdsvis) ved at regulere spændingen kanaler. Bemærk: Rediger SSC og FSC akseskalaer med henblik på bedst visualisere den komplette celle population i plottet. Kan oprettes, gemmes og bruges til fremtidige opkøb Et instrument indstilling skabelon for hver celletype af interesse. </li><li> Åbn den&quot;Region&quot; fanen i softwaren. Tegn en passende stor region (&quot;gate&quot;) omkring den ønskede population. Bemærk: Internalisering af nanopartikler inducerer en SSC forskydning af cellerne. Hvis porten er for snævert begrænset omkring cellepopulationen af ​​interesse, vil de indsamlede data sandsynligvis glip en del af de celler, der skal påvises. </li><li> Brug to ufarvede prøver, én til brug som blindprøve og en erstatningssag mod PI farvning (ekstraudstyr), en enkelt-farvede prøve med den passende fluorokrom for hver fluorescens kanal, der skal kompenseres. Bemærk: Anvend en anden 1,5 ml prøverør for hver fluorokromkonjugerede antistof, der skal anvendes i forsøget mærkning. </li><li> Åbn &quot;Kompensation fanebladet&quot; i &quot;Indstillinger Instrument&quot;-boksen. Øge eller mindske kompensation faktor under anskaffelsen indtil det fluorescens intensitet i spillover-kanalen er nogenlunde det samme for fluorochromet postivt og negativt befolkning. </li><li> Anskaf nanopartikel-behandlede prøver efter kompensationen er blevet justeret. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+nanomaterials+and+biological+systems:+Implications+to+personalized+nanomedicine.">Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).</li><li>Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+benefits+and+hazards+of+engineered+nanoparticles.">Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+engineered+nanomaterials.">Immunological properties of engineered nanomaterials.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).</li><li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation.">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462, 449-460 (2009).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalisation+regulates+polyamidoamine+dendrimer+toxicity+on+blood-brain+barrier+cells+and+the+modulation+of+key+inflammatory+receptors+on+microglia.">Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia.</a> Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).</li><li>Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+engineered+nanoparticles+with+in+vitro+toxicity+assays.">Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays.</a> Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).</li><li>Malvindi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+nanoparticles+biocompatibility+and+their+potential+for+gene+delivery+and+silencing.">SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing.</a> Nanoscale. 4, 486-495 (2012).</li><li>Bardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+NPs:+Promising+Candidates+for+Drug+and+Gene+Delivery.">SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery.</a> Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).</li><li>Bardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+amino+functionalized+CdSe/ZnS+quantum-dot-Doped+SiO2+nanoparticles+with+primary+neural+cells+and+their+gene+carrying+performance.">The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance.</a> Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+andgreen+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at Miltenyi Biotech GmbH har sponsoreret indsendelse af dette manuskript. HiQ-Nano Company ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) er en nanoteknologi spin off selskab opstået fra IIT.

Forsøgsprotokollen præsenterer meget afgørende punkter, der skal tages i betragtning. Det er virkelig vigtigt at arbejde ved 4 ° C (på is), og muligvis i mørke under alle farvningsprocedurer trin, fordi højere temperaturer og lys negativt kan påvirke farvning udbytte. Nanopartikler kan sonikeres til bedre resuspenderes umiddelbart før brug. Et korrekt flowcytometri analyse kræver en korrekt kalibrering i de forskellige kanaler. Kalibrering af instrumentet bør udføres før hver eksperimentel session. Udover tekniske problemer med den instrumentering, kan der også være problemer med antistof mærkning. Det er obligatorisk at anvende antistoffet i en passende koncentration. Hvis koncentrationen er for høj eller for lav, kan utilfredsstillende signalintensiteter være følgen. Ulemperne ved denne teknik omhandler behovet for at arbejde med monodisperse prøver, den manglende evne til at lokalisere denoprindelsesstedet af signalet (dvs. forskellige cellulære rum). Der er også nogle begrænsninger i valget af fluorokromer, der skal anvendes i kombination: bølgelængden af ​​excitation og emission bands skal være tilstrækkeligt adskilt for at tillade, at deres passende måling. Hvis de anvendte antistof spektre overlapper hinanden, er en korrekt krævede kompensation. Flowcytometri er en kraftfuld metode til celleanalyse i nærvær eller fravær af nanopartikler. Denne teknik tillader en multiparametric undersøgelse af en celle, et stort antal begivenheder undersøgte hurtige analyse (mere end 1.000 celler / sek), reproducerbarhed og statistiske målinger. Prøver kan behandles uden at miste cellelevedygtighed. Ved hjælp af fluorescens-mærkede nanopartikler er det muligt at kvalificere og kvantificere deres internalisering i cellesubpopulationer, der er identificeret ved specifikke markører eksponeret på cellemembranen. Cell parametre kan ændre sig i nærvær af s<html> PECIFIKKE nanopartikler. Afhængigt af formålet med undersøgelsen, kan disse variationer kan anvendes til at identificere et specifikt fænomen, såsom side spredning af celler, der proportionalt øger med stigende nanopartikel internalisering sats. Nanopartikel-inducerede modifikationer af celleoverfladen kan også repræsentere en begrænsning af teknikken. Af denne grund, skal cellemembranreceptorer omsætning skal altid tages i betragtning og eventuelt kendt på forhånd præcist at karakterisere cellepopulationen af ​​interesse. Ekstreme nedskrivninger på membran osmose i nanopartikel overbelastet prøver kan føre til celledød. Nanomateriale dosisafhængig toksicitet bør empirisk testet for hver cellepopulation. Klart definerede døde celler skal udelukkes fra fluorescens kvantificering. For eksempel Annexin V / PI farvning er en af ​​de mange metoder, der sædvanligvis anvendes til at detektere både nekrotiske og apoptotiske celler. &quot;&gt; GFP-udtrykkende primære celler er også et effektivt værktøj til at vælge en bestemt cellesubpopulation og indsamle data uden prelabeling. Kombinationen med supplerende fluorescerende nanopartikler giver mulighed for en meget hurtig og præcis kvantificering af celle-nanopartikel interaktion. Drug eller gen levering menes at forbedres i fremtiden ved anvendelse af nanopartikler i stand til at frigive et specifikt lægemiddel belastning i udvalgte væv. Ansættelse af nanopartikler som specifikke levering bærere og / eller immunmodulatorer for farmaci forudsætter kendskab til det biologiske miljø (dvs. gennem flowcytometri) at undersøge celle-nanopartikel interaktioner.

Konstruerede nanomaterialer er i dag inspirerende interesse biovidenskabelige forskere for potentielle ansøgninger til biomedicin 1. En bred vifte af uorganiske og organiske materialer kan anvendes til at fremstille nanostrukturer med forskellige former, fysiske og kemiske egenskaber. Blandt disse strukturer, manipuleret nanopartikler af kugleform viste stort potentiale for diagnostik og translationel medicin 2.. Deres kerne og overflade design er drevet af en mulig anvendelse, og det indebærer en dybtgående undersøgelse af target celle respons efter nanopartikel kontakt og samspil. Nanopartikler, der menes at være bevidst administreres til mennesker vil komme i direkte kontakt med flere typer af immunceller. Deres ansvar for at opretholde kroppens integritet gør dem til et afgørende emne for undersøgelse i nanomedicin 3. Den cellulære del af det medfødte immunsystem er hovedsageligt repræsenteret ved phagocytes. Blandt dem, monocyt / makrofaglinien afledte celler, herunder centralnervesystemet bosiddende mikroglia, spiller en central rolle i immunforsvaret 4,5. De er i stand til at udløse beskyttende responser inden for få timer efter at have mødt med fremmedlegemer. Desuden monocytceller koordinere og instruere svaret adaptive immunrespons gennem frigivelse af cytokiner. Alle disse begivenheder ske, selv i tilstedeværelse af manipuleret materialer, som i vid udstrækning opfattes som &quot;ikke-selv&quot; af immunsystemet 6. Blandt de metoder, der historisk set er benyttet i immunologi for celle analyse, flowcytometri repræsenterer en af ​​de mest kraftfulde værktøjer. Desuden tilgængeligheden af ​​teknologier til identifikation eller oprensning af en specifik immun subpopulation (ofte udnytte udelukkelse eller tilstedeværelsen af ​​en enkelt membran protein) giver mulighed for en præcis undersøgelse af virkningerne af en bestemt nanopartikel på denne særlige primær cell type 7. Dog kan celler præsentere fysiologiske og morfologiske forandringer efter eksponering for nanopartikler. Samt, kan nanopartikler interferere med specifikke optiske parametre, såsom absorption eller emission af lys ved definerede bølgelængder, påvirke de opnåede resultater 8. Så bør grænserne for brug og eventuelle tilpasninger af klassiske immunologiske assays til studiet af nye materialer overvejes. Dette arbejde vedrører påvisning af nanopartikel interaktioner med primære immunceller ved flowcytometri. For at løse dette problem, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartikler blev ansat som en model nanomateriale til at beskrive metoden. Silicapartikler kan fremstilles på en meget præcis måde i nano-målestok. Størrelse, form og overflade egenskaber, såsom ladning eller hydrofobicitet, kan fintunet til at øge deres biokompatibilitet 9. Mange funktioner i SiO 2 nanopartikler tillader dem at blive brugt som enmodel for drug delivery partikler 10. Desuden kan fluorescerende farvestoffer eller kvantepunkter blive indfanget eller er knyttet til disse partikler, der tilbyder nyttige nano-værktøjer til afbildningsformål 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-088</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 (ATCC Modified)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum (lot n&#176; 1131917)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 2.5%</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Pooled Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b-VioBlue human &#38; mouse</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACS BSA Stock Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Rinsing Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Running buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Human Pan monocyte isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood Column Kit</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MidiMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Red Blood Cell Lysis Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pre-Separation Filters 30 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Analyzer flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Calibration Beads</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">GEH17544202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:272px;">FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:272px;">Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">12-well plate Falcon</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry

Nanopartikler er udstyret med meget lovende egenskaber til terapeutiske og diagnostiske formål. Dette arbejde beskriver en hurtig og pålidelig metode til analyse ved flowcytometri at studere nanopartikel interaktion med immunceller. Primære immunceller kan oprenses let fra humane eller muse-væv ved hjælp af antistof-medieret magnetisk isolation. I første omgang kan de forskellige cellepopulationer kører i et flowcytometer være kendetegnet ved den fremadrettede spredte lys (FSC), som er proportional med cellens størrelse, og side-spredte lys (SSC), relateret til celle interne kompleksitet. Desuden fluorescensmærkede antistoffer mod specifikke celleoverfladereceptorer mulighed for identifikation af flere subpopulationer i samme prøve. Ofte alle disse funktioner varierer, når cellerne er forstærket af eksterne stimuli, der ændrer deres fysiologiske og morfologiske tilstand. Her er 50 nm FITC-SiO 2 nanopartikler bruges som en model til at identificere the internalisering af nanostrukturerede materialer i humant blod immunceller. Cellen fluorescens og side-spredte lys stigning efter inkubation med nanopartikler tilladt os at definere tid og koncentration afhængighed af nanopartikel-celle-interaktion. Desuden kan en sådan protokol udvides til at undersøge rhodamin-SiO2 nanopartikel interaktion med primær microglia centralnervesystemet hjemmehørende immunceller, isoleret fra muterede mus, der specifikt udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i monocyt / makrofaglinien. Endelig flowcytometri data relateret til nanopartikel internalisering i cellerne er blevet bekræftet af konfokal mikroskopi.

Flowcytometri er et nyttigt redskab til at identificere og karakterisere forskellige celler, og det er den teknik valg at identificere specifikke immunceller, såsom monocytter, granulocytter, T-celler, B-celler, naturlige dræberceller (NK)-celler, dendritiske celler (DC&#39;er), og andre subpopulationer af leukocytter. I bestræbelserne på at bedre karakterisere hvide blodlegemer adfærd som reaktion på nanopartikler, udførte vi internalisering assays med primære leukocytter isoleret fra blod fra sunde donorer (figur 1 og 2), og human monocyt-cellelinie (THP-1-celler, figur 3) . Som rapporteret i figur 1A blev de tre store blod leukocytunderpopulationer klart identificeret ved fremad og side spredning efter PBMC&#39;er isolation. Hertil kommer, efter FITC-SiO2 behandling lymfocytter (grå), monocytter (blå) og granulocytter (rød) har en anden nanoparticle internalisering sats som fremgår af grøn fluorescens intensitet (figur 1B). Den beskrevne protokol tillader oprensning af primære CD14 positive monocytter fra PBMC&#39;er. 2A rapporterer flowcytometri dot plot af CD14 +-monocytter i nærvær af FITC-SiO2. Figur 2B viser FITC-SiO2 internalisering kvantificeret i de samme celler og udtrykt i logaritmisk skala histogrammet. Lignende internaliseringsfaktorer eksperimenter blev udført på THP-1-monocytter behandlet med stigende koncentrationer af FITC-SiO 2 nanopartikler. Ubehandlede celler blev anvendt som negativ kontrol Figur 3A viser en dosisafhængig stigning i side spredning med uændret fremadrettet spredning i THP-1-cellelinien.. I figur 3B sammen med histogrammerne for SSC og FSC på hvert FITC-SiO2 nanopartikel testede koncentration, betyder fluorescensintensitet (MFI) kvantificering præsenteres. Disse data tyder på, at behandling med FITC-SiO 2 nanopartikler inducerer en dosisafhængig internalisering i monocytter fremhævet af forøgelse af intracellulær granularitet (side scattering) og fluorescens (grøn kanal). For at få yderligere indsigt i den type samspil mellem immunceller og nanopartikler blev primære blandede glial kulturer isoleret og microglia, centralnervesystemet bosiddende immunceller, blev renset. Anvendelsen af ​​en transgen musemodel udtrykker grønt fluorescerende mikroglia tillader visualisering af forskellige neuro-inflammatoriske mekanismer. Den transgene mus B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J anvendes i dette arbejde udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af CX3CR1 promotoren 12. Efter 7 dage in vitro (DIV) fluorescensmikroskopi viser en blandet primær glial kultur med et stort antal astrocytter (GFP negativ adhærent cellee) og nogle grønne celler (GFP positive, figur 5A). I denne musemodel kan tre glial subpopulationer skelnes ved flowcytometri med et enkelt CD11-antistof-farvning: den første CD11 - GFP - (astrocytter og andre gliaceller), et andet bestemt gruppe microglial CD11 + GFP +-celler, og en tredje CD11 + GFP - delpopulation (figur 4A). Disse to sidstnævnte subpopulationer begge er i stand til at internalisere nanopartikler med en let øget effektivitet af GFP +-populationen (der repræsenterer patruljering umodne mikroglia ved transkription af CX3CR1-promotor), som vist ved flowcytometri analyse (figur 4B). Det skete internalisering kan verificeres yderligere ved konfokal mikroskopi under anvendelse af samme slutkoncentration på rhodamin-SiO 2 nanopartikler som vist i figur 5B. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Altid&quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> Figur 1. FITC-SiO 2 nanopartikel internalisering i isolerede blodleukocytter. A) Repræsentant fremadrettet spredning (FSC) versus side spredning (SSC) flowcytometri punktdiagram over Ficoll-Paque isolerede blodleukocytter. B) Grøn fluorescens overlay histogram plot af de tre store blod leukocyt cellesubpopulationer i nærværelse af 1 nM FITC-SiO 2 nanopartikler (+45 mV) for 1 time. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; Figur 2. FITC-SiO 2 nanopartikel internalisering i CD14 + rensede monocytter. A) Repræsentant fremadrettet spredning (FSC) versus side spredning (SSC) flowcytometri dot-plot af oprensede CD14 positive monocytter. B) Grøn fluorescens histogram plot af den rensede monocyt delpopulation i overværelse af 1 nM FITC-SiO 2 nanopartikler (+45 mV) for 1 time. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> Figur 3. Effekter af FITC-SiO 2 nanopartikel internalisering på THP-1 celler. A) Repræsentant fremadrettet spredning (FSC) versus side scattering (SSC) flowcytometri dot plot af THP-1 monocyt cellelinie efter 1 time eksponering af FITC-SiO 2 nanopartikler stigende koncentration. B) koncentrationsafhængig variation af side scattering (SSC), fremadrettet spredning (FSC) og grøn fluorescens i tilstedeværelse af FITC-SiO 2 nanopartikler (+45 mV) for 1 time. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> Figur 4.. Rhodamin-SiO2 nanopartikel internalisering i den primære mikroglia isoleret fra B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J-mus. A) grønt fluorescerende protein (GFP) versus CD11-VioBlue flowcytometri dot plot af PRimary blandede glia isoleret fra B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J-mus. CD11 + GFP + og CD11 + GFP - populationer er vist i det øverste højre og nederste højre kvadrant, henholdsvis B) Red fluorescens overlay histogram plot af mikroglia undergrupper i nærværelse af 1 nM Rhodamine-SiO 2 nanopartikler (+45 mV) 30. min (rød histogram) versus kontrol (grå histogram). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> Figur 5. Visualisering af GFP +-mikroglia. (A) Fluorescensmikroskopi ved 7 DIV og (B) Konfokal mikroskopiaf Rhodamin-SiO 2 nanopartikel internalisering (røde pile) i GFP +-microglia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry at JoVE.com

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Analyse af nanopartikel interaktion med definerede underpopulationer af immunceller ved flowcytometri.

Påvisning af fluorescerende Nanopartikel Interaktioner med Primary Immune cellesubpopulationer ved flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studere Interaktioner af<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

påvisning af<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant overfladeglycoprotein Skift af magnetisk cellesortering og flowcytometri

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Forskelsbehandling af syv immun celle Subsets ved to-fluorokrom Flow flowcytometri

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...