Name: detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry
Uploaded: 2014-03-28T15:00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia. Författarna vill tacka för Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Tyskland) för sponsring av detta manuskript, Dr Paolo Petrucciani (Institutionen för Immun hematologi och transfusions service, sjukhus Lotti Pontedera, Pisa, Italien) för att ge humana buffy coats och Prof. Massimo Pasqualetti (Institutionen för biologi - Enheten för Cell-och utvecklingsbiologi, Universitetet i Pisa, Pisa, Italien) för bostäder musen kolonin.

ETIK UTTALANDE Human-och djurprover behandlades följa riktlinjerna i det italienska hälsoministeriet, lag 116/92 och Europeiska gemenskapernas rådets direktiv 86/609/EEG. 1. Monocyte Cell Cultures <ol><li> Kultur humana THP-1-celler i T-75-kolvar innehållande RPMI-1640-medium kompletterat med 10% humant serum, 50 U / ml penicillin och 50 mg / ml streptomycin, 0,05 mM β-merkaptoetanol vid 37 ° C i 5% CO2. </li><li> Split kulturer när sammanflytande (var 3-5 dagar). </li></ol> 2. Isolering av perifera blodmononukleära celler (PBMC) från buffy coats <ol><li> Före start av isolering protokoll bereds en lösning av fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2, 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 0,5% bovint serumalbumin (BSA), tillsätta 5 ml BSA-stamlösning till 95 ml Sköljning buffert (1: 20 utspädning). Lufta den buffert och hålla det kallt (2-8° C). VIKTIGT: Om du inte degas bufferten kan leda till mindre än optimala resultat eftersom bubblor kan blockera isolering kolumnen (se steg 3.2). Anm: Antikoagulantia citratdextros formeln-A (ACD-A) eller citrat-fosfat dextros (CPD), kan alternativt användas. Omvänt kan andra albumin proteiner eller sera från andra arter ersätter BSA. Använd inte buffertar som innehåller Ca 2 + eller Mg 2 +. </li><li> Skaffa buffy coats från friska donatorer (i åldern 20 till 60 år gammal). </li><li> Förbered 50 ml koniska rör för densitetsgradientcentrifugering. Bestäm antalet rör som behövs för bearbetning av blod (varje rör kan bearbeta 35 ml utspätt blod) och tillsätt 15 ml av Ficoll-Paque till varje tomt rör. </li><li> Späd 8 ml blod med 24 ml PBS / BSA / EDTA-lösning (1:4 utspädning). </li><li> Skiktet försiktigt den utspädda lösningen på toppen av Ficoll-Paque (densitet = 1,077 g / ml) i var och en av 50 ml koniska rör. Blanda inteblodet och Ficoll-Paque. VIKTIGT: För att undvika blandning av blodet och Ficoll-Paque, hålla röret i 45 ° vinkel och lager blodblandningen långsamt. </li><li> Centrifugera vid 400 x g under 30 min vid 4 ° C. Mononukleära celler (MNC) kommer att förbli på den plasma Ficoll-Paque-gränssnittet, medan granulocyter och erytrocyter sediment på grund av högre densitet vid det osmotiska trycket av Ficoll-Paque. </li><li> Överför interfasceller (Perifera mononukleära blodceller, PBMC) i ett annat 50 ml rör fyllt med PBS / BSA / EDTA och centrifugera vid 300 xg under 10 minuter vid 4 ° C. </li><li> Tvätta pelleten två gånger med PBS / BSA / EDTA för avlägsnande av blodplättar. Centrifugera vid 200 x g under 10 min vid 4 ° C. </li><li> Kultur cellerna i komplett RPMI-1640 med 10% humant serum och antibiotika eller gå vidare till monocyter rening. </li></ol> 3. Rening av Primär Monocyter från PBMC <ol><li> Isolera monocyter från PBMC genom magnetisk pärla separation med hjälp av Humen Pan monocyte isoleringssats: <ol><li> Passera celler genom en 30 um nylonnät (föravskiljning filter, 30 mikrometer) för att avlägsna eventuella cellklumpar. </li><li> Bestäm antalet celler med hjälp av en hemocytometer. </li><li> Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g under 10 min vid rumstemperatur (RT). Sug ut supernatant helt. </li><li> Resuspendera cellpelleten i 30 pl av PBS / EDTA / BSA-buffert per 10 7 totala celler. </li><li> Tillsätt 10 l FcR Blocking Reagens per 10 7 totala celler. </li><li> Tillsätt 10 l av Biotin-Antibody Cocktail per 10 7 totala celler. </li><li> Blanda väl och inkubera i 5 minuter vid 2-8 ° C. </li><li> Tillsätt 30 ul av buffert per 10 7 totala celler. </li><li> Tillsätt 20 l av Anti-Biotin mikrokulor per 10 7 totala celler. </li><li> Blanda väl och inkubera i 10 minuter vid 2-8 ° C. </li><li> Resuspendera upp till 10 8 celler i 500 l av PBS / EDTA / BSA-buffert. </li></ol></li><li> Magnetisk separation <ol><li> I enlighet med det totala antalet celler, välj en lämplig MACS kolumn och MACS Separator (se MACS kolumn datablad). </li><li> Placera kolonnen i magnetfältet i MACS Separator. </li><li> Förbered kolonnen genom att skölja med lämplig mängd PBS / EDTA / BSA-buffert (MS kolumner: 500 l, LS kolumner: 3 ml). OBS: Kolonner är &quot;flow stop&quot; och inte köras torr. </li><li> Applicera cellsuspension på kolonnen. Samla genomströmning innehåller omärkta celler, som representerar den anrikade monocytfraktionen. </li><li> Tvätta kolonnen 3x med PBS / EDTA / BSA-buffert (500 | il för MS och 3 ml för LS per tvätt). </li><li> Samla omärkta celler som passerar igenom, som representerar de anrikade monocyter cellerna, och lägga till i genomströmning från avsnitt 3.2.4. Obs: Tvätta kolonnen genom att lägga till PBS / EDTA / BSA buffert alikvoter endast när kolumnbehållaren är tom. </li><li> (Valfritt) Ta bort kolumn frånseparator och placera den på en lämplig uppsamlingsröret. Pipet bufferten på kolonnen (MS kolumner: 1 ml; LS kolumner: 5 ml). Skölj omedelbart ut de magnetiskt märkta nonmonocyte celler genom att stadigt trycka in kolven i kolonnen. </li><li> Kultur renade monocyter i komplett RPMI-1640 med 10% humant serum och antibiotika. </li></ol></li></ol> 4. Rening av Primär Monocyter från helblod <ol><li> Man renade monocyter från helblod med användning av helblod monocyt isoleringskit enligt tillverkarens instruktioner. </li></ol> 5. Nanopartiklar Interna i blodleukocyter och renades Monocyter <ol><li> Tallrik 5 x 10 5 celler / ml (1 ml / brunn) av de isolerade PBMC eller renade CD14-positiva monocyter i en 12-brunnars platta. </li><li> Vortex FITC-SiO 2 nanopartiklar stamlösning och återsuspendera i komplett medium till en fungerande koncentration av 100 nM. </li><li> Tillsätt 10 l av arbets nanopartikeln suspension (100 nM) för behandlade proverna för att nå en nanoparticle slutlig koncentration av 1 nM. Tillsätt samma volym av fullständigt medium för obehandlade kontroller i varje brunn. </li><li> Efter 1 tim intemalisering samla proverna i en 1,5 ml polypropylen-rör och centrifugera dem under 3 min vid 6000 xg vid RT. </li><li> Tvätta pellet med 1 ml av körningsbuffert 3 min vid 6000 xg vid RT. </li><li> Återsuspendera pelleten i 200 | il av rinnande buffert. Cellerna är nu redo för läsning genom flödescytometri. </li></ol> 6. Isolering av Primära Blandade Glial kulturer (se Bertero et al. 7) 7. Nicasiling en blandad Glial Confluent cellodling <ol><li> Tvätta en T-75 kolv en gång med 10 ml PBS (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), tillsätt sedan 10 ml Versene och inkubera vid 37 ° C i 5-7 min. </li><li> Pipettera supernatanten upp och ned flera gånger för att lösgöra cellerna från T-75 yta och upplösacellaggregat. </li><li> Överför i en 15 ml polypropylen rör cellsuspensionen. Samla en liten mängd cellulär suspension för att räkna cellerna med en hemocytometer. </li><li> Centrifugera cellsuspensionen i 5 min vid 300 xg vid rumstemperatur. </li><li> Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i en slutlig koncentration av 5 x 10 5 celler / ml i gliaceller komplett odlingsmedium. </li><li> Plate 0,5 ml / brunn i en 24-brunnars platta och låta cellerna sedimentera under 2-4 h före nanoparticle behandling. </li></ol> 8. Nanopartiklar Interna i mikroglia <ol><li> Addera 500 pl av komplett gliaceller odlingsmedium (till obehandlade kontroller) eller 500 | il av en 2x Rhodamine-SiO 2 nanoparticle suspension i komplett gliaceller odlingsmedium (för behandlade prover) till varje brunn. </li><li> Pipettera cellerna så att avskiljandet av nonrapid vidhäftande celler på de valda tidpunkter och samla dem i 2 ml polypropylenrör. </li><li> Addera 500 plav Versene till varje brunn och inkubera plattan vid 37 ° C under 5 min, sedan bort återstående cellfraktionen och samla varje prov med motsvarande nonadhering cellerna i det föregående steget. </li><li> Centrifugera proverna under 3 min vid 300 xg vid rumstemperatur. </li><li> Återsuspendera pelleten i 100 | il av AutoMACS löpbuffert. </li></ol> 9. Färgning med CD11b-VioBlue <ol><li> Tillsätt 10 pl av VioBlue-CD11b human / mus-antikropp till 100 pl av cellsuspensionen (01:11 förhållande) i rinnande buffert och inkubera 10 minuter vid 4 ° C. </li><li> Tillsätt 1 ml körningsbuffert och blanda cellsuspensionen. </li><li> Centrifugera varje prov under 3 min vid 300 x g.. </li><li> Kassera supernatanten och suspendera pelleten i 100-150 l av löpande buffert. </li><li> Läs proven till cytometer (lagra proverna vid 4 ° C mellan de sista två stegen). VIKTIGT: innan analysera proverna, fortsätt till ersättning för överlappande signaler in emissionsspektra observerats mellan olika fluorokromer (fluorokromkonjugerade nanopartiklar eller antikroppar). </li></ol> 10. Spectral Spill Over Ersättning <ol><li> Öppna &quot;Instrumentinställningar&quot; rutan (finns i alla instrument program). OBS: Om du använder ett annat instrument än det som redovisas i Material tabell, se instrumentets specifika handboken för förvärvs detaljer. </li><li> Förvärva obehandlade provet (utan nanopartiklar) vid låg fluidic hastighet (om det tillåts av instrumentet). Under förvärvs, justera manuellt framåt och sidospridning (FSC och SSC, respektive) genom att reglera spänningskanalerna. Anm: Ändra SSC och FSC axelskalor för att på bästa visualisera hela cellpopulationen i täppan. Ett instrument som anger mall för varje celltyp av intresse kan skapas, sparas och användas för framtida förvärv. </li><li> Öppna specifik&quot;Region&quot; fliken i programmet. Rita en lämplig stor region (&quot;gate&quot;) kring den önskade populationen. Anm: Internalisering av nanopartiklar inducerar ett SSC förskjutning av cellerna. Om grinden är för nära begränsat kring cellpopulation, kommer de förvärvade uppgifterna förmodligen missar en del av de celler som skall detekteras. </li><li> Använd två ofärgade prover, en för användning som blankprov och ett för ersättning mot PI färgning (tillval), en singel-färgade prov med lämplig fluorokrom för varje fluorescens kanal som ska kompenseras. Notera: Använd ett annat 1,5 ml provrör för varje fluorokrom-konjugerad antikropp som skall användas i experimentet märkningen. </li><li> Öppna &quot;Ersättning fliken&quot; i &quot;Instrumentinställningar&quot; rutan. Öka eller minska kompensationsfaktorn under förvärvet tills fluorescensintensiteten i spillover-kanalen är ungefär densamma för fluorokrom postiv och negativ population. </li><li> Förvärva nanopartiklar behandlade prover efter att ersättningen har justerats. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+nanomaterials+and+biological+systems:+Implications+to+personalized+nanomedicine.">Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).</li><li>Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+benefits+and+hazards+of+engineered+nanoparticles.">Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+engineered+nanomaterials.">Immunological properties of engineered nanomaterials.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).</li><li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation.">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462, 449-460 (2009).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalisation+regulates+polyamidoamine+dendrimer+toxicity+on+blood-brain+barrier+cells+and+the+modulation+of+key+inflammatory+receptors+on+microglia.">Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia.</a> Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).</li><li>Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+engineered+nanoparticles+with+in+vitro+toxicity+assays.">Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays.</a> Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).</li><li>Malvindi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+nanoparticles+biocompatibility+and+their+potential+for+gene+delivery+and+silencing.">SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing.</a> Nanoscale. 4, 486-495 (2012).</li><li>Bardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+NPs:+Promising+Candidates+for+Drug+and+Gene+Delivery.">SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery.</a> Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).</li><li>Bardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+amino+functionalized+CdSe/ZnS+quantum-dot-Doped+SiO2+nanoparticles+with+primary+neural+cells+and+their+gene+carrying+performance.">The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance.</a> Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+andgreen+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li></ol>

Författarna förklarar att Miltenyi Biotech GmbH har sponsrat inlämnandet av detta manuskript. HiQ-Nano Company ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) är en nanoteknik spin off företag uppstått från IIT.

Den experimentella protokollet presenterar mycket viktiga punkter som skall beaktas. Det är verkligen viktigt att arbeta vid 4 ° C (på is) och eventuellt i mörker under alla färgningssteg, eftersom högre temperaturer och ljus kan påverka färgning avkastningen negativt. Nanopartiklar kan sonikeras vara bättre suspenderas strax före användning. En korrekt flödescytometrianalys kräver en korrekt kalibrering av de olika kanalerna. Kalibrering av instrumentet ska utföras före varje experimentell session. Förutom tekniska problem med instrumenteringen, kan det också finnas problem med märkningen kroppen. Det är obligatoriskt att använda antikroppen i en lämplig koncentration. Om koncentrationen är för hög eller för låg, kan dissatisfying signalintensitet bli följden. Nackdelarna med denna teknik berör behovet av att arbeta med monodispersa prover, oförmågan att lokaliseraplats varifrån signalen (dvs. olika cellulära fack). Det finns också vissa begränsningar i valet av fluorokromer som kan användas i kombination: våglängden för excitation och emissionsbanden måste vara tillräckligt åtskilda för att tillåta deras lämplig mätning. Om de används spektra antikroppslappar varandra, är en riktig ersättning krävs. Flödescytometri är en kraftfull metod för cellanalys i närvaro eller frånvaro av nanopartiklar. Denna teknik medger en multiparameter studie av en cell, ett högt antal händelser undersöktes, snabbheten i analys (mer än 1000 celler / sek), reproducerbarhet och statistiska avläsningar. Proverna kan processas utan att förlora cellviabilitet. Genom att använda fluorescerande nanopartiklar är det möjligt att kvalificera och kvantifiera deras internalisering i cellpopulationer, som identifieras av specifika markörer som exponeras på cellmembranet. Cell parametrar kan ändras i närvaro av s<html> ÄRSKILDA nanopartiklar. Beroende på syftet med forskningen, kan dessa variationer användas för att identifiera en specifik företeelse, till exempel sido spridning av celler som proportionellt ökar med den ökande nanopartiklar interna takt. Nanopartiklar-inducerade modifieringar av cellytan kan också representera en begränsning av tekniken. Därför måste cellmembranreceptorer omsättning ska alltid tas i beaktande och eventuellt kända i förväg att exakt karakterisera cellpopulationen av intresse. Extrema nedskrivningar av membran osmos i nanopartiklar överbelastad prover kan leda till celldöd. Nanomaterial dosberoende toxicitet bör empiriskt för varje cellpopulation. Klart definierade döda celler måste uteslutas från fluorescens kvantifiering. Till exempel är Annexin V / PI-färgning en av flera metoder som vanligen används för att detektera både nekrotiska och apoptotiska celler. &quot;&gt; GFP-uttryckande primära celler är också ett kraftfullt verktyg för att markera en viss cell subpopulation och samla in data utan prelabeling. Kombinationen med kompletterande fluorescerande nanopartiklar ger en mycket snabb och exakt kvantifiering av cell-nanopartiklar interaktion. Drog eller gentillförsel tros förbättras i framtiden genom tillämpning av nanopartiklar kan släppa en viss läkemedelsbelastning i utvalda vävnader. Employment av nanopartiklar som specifika leverans bärare och / eller immunmodulatorer för farmaci kräver kunskap om den biologiska miljön (dvs. genom flödescytometri) för att studera cell-nanopartikelinteraktioner.

Konstruerade nanomaterial är numera inspirerande intresse livforskare för potentiella applikationer till biomedicin 1. Ett stort antal olika oorganiska och organiska material kan användas för att framställa nanostrukturer med olika former, fysikaliska och kemiska egenskaper. Bland dessa strukturer, nanopartiklar av sfärisk form visat stor potential för diagnostik och translationell medicin 2. Deras kärna och yta design drivs av en eventuell ansökan och det innebär en djupgående studie av mål-cellssvar efter nanopartiklar kontakt och samspel. Nanopartiklar som tros vara avsiktligt ges till människor och som kommer att komma i direkt kontakt med flera olika typer av immunceller. Deras ansvar för att upprätthålla kroppsintegritet gör dem till en viktig ämne för utredning i nanomedicin 3. Den cellulära delen av det medfödda immunförsvaret är främst representerat av phagocyter. Bland dem, monocyten / makrofag härstamning härledda celler, inklusive det centrala nervsystemet bosatta mikroglia, spelar en viktig roll i immunförsvaret 4,5. De kan utlösa skyddande svar inom några timmar efter att ha mött med främmande föremål. Dessutom är de monocytiska celler samordna och instruera det adaptiva immunsvaret genom frisättning av cytokiner. Alla dessa händelser inträffa även i närvaro av framtagna material, som till stor del uppfattas som &quot;nonself&quot; av immunsystemet 6. Bland de metoder som historiskt använts i immunologi för cellanalys, flödescytometri representerar en av de mest kraftfulla verktyg. Dessutom möjliggör tillgången på teknik för identifiering eller rening av ett specifikt immun subpopulation (ofta utnyttja undantag eller närvaron av en enda membranprotein) en noggrann undersökning av effekterna av en viss nanopartikel på just den primära cell typ 7. Emellertid kan cellerna presentera fysiologiska och morfologiska förändringar efter exponering för nanopartiklar. Vad bra, kan nanopartiklar störa specifika optiska parametrar, såsom absorption eller emission av ljus vid definierade våglängder, att påverka de erhållna resultaten 8. Så, begränsningar för användning och eventuella anpassningar av klassiska immunologiska analyser för att studera nya material bör övervägas. Detta arbete avser detektion av nanopartiklar interaktioner med primära immunceller genom flödescytometri. För att behandla denna fråga, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartiklar användes som modell nanomaterial för att beskriva metoden. Kiseldioxidpartiklar kan framställas på ett mycket exakt sätt i nanometrisk skala. Storlek, form och ytegenskaper, såsom laddning eller hydrofobicitet, kan finjusteras för att öka deras biokompatibilitet 9. Många funktioner i SiO 2 nanopartiklar gör att de kan användas som enmodell för läkemedelstillförsel partiklar 10. Dessutom kan fluorescerande färger eller kvantprickar infångas eller kopplas till dessa partiklar som erbjuder användbara nanoverktyg för avbildningsändamål 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-088</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 (ATCC Modified)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum (lot n&#176; 1131917)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 2.5%</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Pooled Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b-VioBlue human &#38; mouse</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACS BSA Stock Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Rinsing Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Running buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Human Pan monocyte isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood Column Kit</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MidiMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Red Blood Cell Lysis Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pre-Separation Filters 30 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Analyzer flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Calibration Beads</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">GEH17544202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:272px;">FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:272px;">Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">12-well plate Falcon</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry

Nanopartiklar är utrustade med mycket lovande egenskaper för terapeutiska och diagnostiska ändamål. Detta arbete beskriver en snabb och tillförlitlig metod för analys genom flödescytometri för att studera nanoparticle samspel med immunceller. Primära immunceller kan lätt renas från humana eller mus-vävnader genom antikroppsmedierad magnetisk isolering. I första hand, kan de olika cellpopulationer som körs i en flödescytometer särskiljas genom den framåt spritt ljus (FSC), som är proportionell mot cellstorlek och sido spritt ljus (SSC), relaterade till cell interna komplexitet. Dessutom fluorescerande antikroppar mot specifika receptorer på cellytan det möjligt att identifiera flera subpopulationer inom samma prov. Ofta, alla dessa funktioner varierar när celler förstärks av yttre stimuli som förändrar deras fysiologiska och morfologiska tillstånd. Här, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartiklar används som en modell för att identifiera: ee internalisering av nanostrukturerade material i människoblodimmunceller. Cell fluorescens-och sido spritt ljus ökning efter inkubation med nanopartiklar tillät oss att definiera tid och koncentrationsberoende interaktion nanopartikel-cell. Dessutom kan ett sådant protokoll utvidgas till att undersöka Rhodamine-SiO 2 nanopartiklar interaktion med primär mikroglia, det centrala nervsystemet bosatta immunceller, isolerad från muterade möss som specifikt uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) i monocyter / makrofager härstamning. Slutligen, flödescytometri uppgifter om nanopartiklar interna in i cellerna har bekräftats av konfokalmikroskopi.

Flödescytometri är ett användbart verktyg för att identifiera och karakterisera olika celler och det är den teknik val för att identifiera specifika immunceller, såsom monocyter, granulocyter, T-celler, B-celler, naturliga mördar (NK)-celler, dendritiska celler (DC), och andra subpopulationer av leukocyter. I försök att bättre karakterisera de vita blodkropparna uppträdande såsom svar på nanopartiklar, utförde vi interna assayer med primära leukocyter isolerade från blod från friska donatorer (figurerna 1 och 2) och med human monocyt cellinje (THP-1-celler, fig 3) . Som rapporterats i figur 1 A, var de tre stora blod leukocyter subpopulationer tydligt anges med framåt-och sidospridning efter PBMC isolering. Dessutom, efter FITC-SiO 2 behandling, lymfocyter (grå), monocyter (blå) och granulocyter (röd) har en annan nanoparticle intemalisering hastigheten såsom visas med grönt fluorescensintensitet (Figur 1B). Det beskrivna protokollet kan reningen av primära CD14-positiva monocyter från PBMC. Figur 2A rapporterar flödescytometri plotten av CD14 +-monocyter i närvaro av FITC-SiO 2. Figur 2B visar FITC-SiO 2 intemalisering kvantifieras i samma celler och uttrycktes i logaritmisk skala histogram. Liknande interna Experimenten utfördes på THP-1-monocyter behandlade med ökande koncentrationer av FITC-SiO 2 nanopartiklar. Obehandlade celler användes som negativ kontroll. Figur 3A visar en dosberoende ökning av sidospridning med en oförändrad fram scattering i THP-1-cellinjen. I figur 3B tillsammans med histogrammen för SSC och FSC vid vardera FITC-SiO 2 nanoparticle testade koncentrationen, medelfluorescensintensitet (MFI) kvantifiering presenteras. Dessa data tyder på att behandling med FITC-SiO 2 nanopartiklar inducerar en dosberoende interna i monocyter belysts av förbättringen av intracellulär granularitet (sidospridning) och fluorescens (grön kanal). För att få ytterligare inblick i den typ av interaktion mellan immunceller och nanopartiklar, var primära blandade gliaceller kulturer isoleras och mikroglia, det centrala nervsystemet bosatta immunceller, renades. Användning av en transgen musmodell som uttrycker grönt fluorescerande mikroglia medger visualisering av olika neuroinflammatoriska mekanismer. Den transgena musen B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J användes i detta arbete uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av CX3CR1 promotor 12. Efter 7 dagar in vitro (DIV), visar fluorescensmikroskopi en blandad primär glial kultur med ett stort antal astrocyter (GFP negativ vidhäftande cells) och några gröna celler (GFP positiva, figur 5A). I denna musmodell kan tre glial subpopulationer särskiljas genom flödescytometri med en enda CD11b-antikroppsfärgning: första CD11b - GFP - (astrocyter och andra gliaceller), en andra distinkt grupp av microglial CD11b + GFP + celler och en tredje CD11b + GFP - subpopulation (Figur 4A). Dessa senare två subpopulationer båda kan internalisera nanopartiklar med en lätt ökad effektivitet av GFP + population (representerande patruller omogen mikroglia genom transkription av CX3CR1 promotorn), såsom visas med flödescytometri-analys (Figur 4B). Den inträffade intemalisering kan ytterligare verifieras genom konfokalmikroskopi med användning av samma slutkoncentration av Rhodamine-SiO 2 nanopartiklar, såsom visas i fig. 5B. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Alltid&quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> Figur 1. FITC-SiO 2 nanopartikel interna i isolerade blod leukocyter. A) representant framåtspridning (FSC) kontra sidospridning (SSC) flödescytometri punktdiagram av Ficoll-Paque isolerade blod leukocyter. B) Grön fluorescens overlay histogram tomt på de tre stora blod leukocyter cellpopulationer i närvaro av en nM FITC-SiO 2 nanopartiklar (45 mV) för 1 tim. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; Figur 2. FITC-SiO 2 nanopartikel interna i CD14 + renade monocyter. A) representant framåt spridning (FSC) kontra sidospridning (SSC) flödescytometri punktdiagram av renade CD14 positiva monocyter. B) Grön fluorescens histogram tomt på det renade monocyter subpopulation i närvaro av 1 nM FITC-SiO 2 nanopartiklar (45 mV) för 1 timme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> Figur 3. Effekter av FITC-SiO 2 nanoparticle intemalisering på THP-1-celler. A) Representative framåtspridning (FSC) versus sido scattering (SSC) flödescytometri plotten av THP-1 monocyt-cellinje, efter 1 tim exponering av FITC-SiO 2 nanoparticles ökande koncentration. B) Koncentrationsberoende variation av sidospridning (SSC) och framåtspridning (FSC) och grön fluorescens i närvaro av FITC-SiO 2 nanopartiklar (45 mV) för 1 timme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> Figur 4. Rodamin-SiO 2 nanopartiklar interna i primär mikroglia isolerad från B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J möss. A) grönt fluorescerande protein (GFP) kontra CD11b-VioBlue flödescytometri punktdiagram av primary blandad Glia isolerades från B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J-möss. CD11b + GFP + och CD11b + GFP - populationer visas i det övre högra och nedre högra kvadranten, respektive B) Röd fluorescens overlay histogram tomt på mikroglia subpopulationer i närvaro av 1 nM Rhodamine-SiO 2 nanopartiklar (45 mV) för 30. min (röd histogram) mot kontroll (grå histogram). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> Figur 5. Visualisering av GFP +-mikroglia. (A) Fluorescensmikroskopi vid 7 DIV och (B) Konfokalmikroskopiav Rhodamine-SiO 2 nanopartiklar interna (röda pilar) i GFP +-mikroglia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry at JoVE.com

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Analys av nanopartiklar interaktion med definierade subpopulationer av immunceller genom flödescytometri.

Upptäckt av fluorescerande nanopartiklar Interaktion med Primär Immun cellsubpopulationer med flödescytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor flödescytometrisystem Analyser av cellulära immunförsvaret i Rhesus makaker

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kvantitativ bedömning av immunceller i den skadade ryggmärg med flödescytometri: en ny användning för en cell reningsmetod

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Icke-kirurgisk intratrakeal instillation av möss med analys av lungor och Lungsjukas Tömning lymfkörtlar med flödescytometri

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mänskliga In Vitro Suppression som screeningmetod för erkännande av en tidig staten Immune obalans

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studera Interaktioner av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrofiler genom flödescytometri-och Time Lapse Mikroskopi

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

detektering av<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant ytglykoprotein Omkoppling av magnetkamera Aktivt cellsortering och flödescytometri

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Diskriminering av sju immunceller delmängder av två-fluorokrom flödescytometri

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...