Name: glycopeptide capture for cell surface proteomics
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics at JoVE.com

Dit onderzoek is ondersteund door het opstarten fonds van Simon Fraser University.

1. Harvest Membranen <ol><li> Voeg hypotonische buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, pH 8,0) met proteaseremmer cocktail op een celpellet (~ 10 8 cellen) en incubeer gedurende 15-30 min. op ijs. Lyseren van de cellen door het monster door injectienaalden (5-10 passages) of homogeniseren van het monster door een Dounce homogenisator (15-30 slagen). Gebruik een hemocytometer en trypan blauw kleuring om de efficiëntie van lysis controleren. </li><li> Het verkrijgen van de microsomale fr...

<ol>
	<li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking.">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li><li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane:+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function.">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+dissection+of+membrane+proteins.">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li><li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.+.">Membrane-protein topology. .</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology.">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li><li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+(PROSPECTS).">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li><li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis.">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics.">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li><li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation,+immunity,+and+autoimmunity.">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li><li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions.">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li><li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin+affinity+capture,+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins.">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li><li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation.">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li><li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery.">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li><li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells.">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li><li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins.">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells.">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+(gagQP)+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome.">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li></ol>

Hier introduceren we een glycopeptide-capture strategie voor het profileren van cel-oppervlakte-eiwitten. De werkwijze kan worden toegepast voor uitgescheiden eiwitten, zoals in bloed, en in andere lichaamsvloeistoffen of celkweek media. Het succes van de werkwijze berust op het volledige digestie van monsters; Daarom, een SDS-PAGE karakterisatie van de spijsvertering efficiëntie noodzakelijk, vooral voor de eerste keer analyse van een monster. Een volledige digestie kan een uitdaging voor ...

Celoppervlakte-eiwitten interageren met de omgeving en relais signalen van buiten naar de binnenkant van een cel. Aldus zijn deze eiwitten, waaronder extracellulaire matrixeiwitten, spelen kritieke rollen in alle aspecten van cellulaire biologie en fysiologie variërend van proliferatie, groei, migratie, differentiatie veroudering enzovoort. Oppervlakte-eiwitten functioneren door interactie met andere cellen, eiwitten en kleine moleculen 1-3. Moleculaire karakterisering van cel-oppervlakte-eiwitten van groot belang, niet alleen voor biologen, maar ook voor farmaceutische bedrijven, aangezien meer dan 60% van geneesmiddelen gericht op het celoppervlak eiwitten 4. Tandem massaspectrometrie (MS), met zijn superieure gevoeligheid, nauwkeurigheid en doorvoer voor de identificatie van eiwitten en peptiden, is een krachtig hulpmiddel voor globale proteomics studies 5,6. Toch, oppervlakte-eiwitten vormen belangrijke uitdagingen voor MS-gebaseerde proteomics, alsde meeste oppervlakte-eiwitten bestaan ​​in kleine hoeveelheden en met zware modificaties. De membraanoverspannende gebieden van de oppervlakte-eiwitten hen hydrofoob te maken; dit is vooral het geval voor multipass transmembraaneiwitten. Het is dus moeilijk om membraaneiwitten in waterige oplossingen oplossen zonder de hulp van een detergens; echter het gebruik van reinigingsmiddelen onderdrukt het algemeen van de HPLC en MS 1,7,8 in proteïne-identificatie. Daarom membraaneiwitten zijn slecht gekenmerkt directe LC-MS gebaseerde proteomics. Glycosylatie is een van de belangrijkste en meest voorkomende post-translationele modificaties die in cel-oppervlakte-eiwitten 9. De enorme complexiteit en de heterogeniteit van glycanen belemmeren peptiden &#39;MS signaal 10. Niettemin hebben verscheidene proteomics methoden deze unieke modificatie gebruikt om oppervlakte-eiwitten te verrijken en de suiker-resten van eiwitten voorafgaand aan LC-MS analyse te verwijderen. Deze methodes onder-lectine gebaseerde affiniteit capture 11 en-hydrazide gebaseerde of boorzuur gebaseerde chemische capture 12 evenals hydrofiele chromatografie scheidingen 8,13. De verwijdering van glycanen transformeert membraaneiwitten om regelmatig eiwitten en vereenvoudigt de MS karakterisering drastisch. Omdat glycosylering vindt ook plaats in uitgescheiden eiwitten die een hoge oplosbaarheid in tegenstelling tot eiwitten membraan, zijn veel glycoproteoomanalyse werkwijzen geoptimaliseerd voor oplosbare eiwitten en gewoonlijk minder glycopeptide selectiviteit en gevoeligheid wanneer ingezet eiwitten 8,14 membraan hebben. Andere methoden bestaan ​​ook te verrijken met name cel-oppervlakte-eiwitten, zoals die met ultracentrifuge 15 en labeling strategieën 16. Een gedetailleerde vergelijking van onze werkwijze en andere bestaande methodes voor het karakteriseren membraaneiwitten werd uitgevoerd onlangs 17 en de resultaten gaven aan dat onze werkwijze evengoed presteren, zonietbeter dan alle vergeleken membraan proteomics methoden, maar met hogere eenvoud. Om u te helpen onderzoekers gebruiken deze methode, we detail hier een algemeen protocol. Deze methode integreert verschillende voordelen van het bestaande glycoproteoomanalyses strategieën en is speciaal ontworpen voor membraanglycoproteïnen, maar de methode werkt net zo goed voor uitgescheiden eiwitten. De kenmerken van deze methode zijn: 1) een volledige solubilisering van membraaneiwitten, 2) een verrijking van glycopeptiden plaats van glycoproteïnen aan de potentiële sterische hindering te verwijderen bij gebruik van een vast substraat vastleggen, 3) het gebruik van hydrazide chemie covalente bindingen te vormen tussen glycopeptiden en vastleggen substraat, zodat de gebonden glycopeptiden stringente wasbehandelingen voor hoge glycoselectivity kan tolereren, en 4) de mogelijkheid om de gehele vastlegprocedure voeren in een buis voor verminderd monster en verkorte procedure duur. Na de implementatie van deze methode om het bestuderen van een varischappij van biologische monsters zoals cellen en weefsels, observeerden we een hoge selectiviteit (&gt; 90%) aan glycoproteïnen 8,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapigest SF</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium periodate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">311448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNGase F</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0704S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Affi-Gel Hz Hydrazide gel</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">153-6047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Worthington Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">LS02115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sep-Pak C-18 cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT054955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor coctail</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:199px;">Amersco</td>
			<td style="width:119px;">568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium sulphite</td>
			<td style="width:199px;">Caledon</td>
			<td style="width:119px;">8360-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Invertase</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alpha-1 trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ribonulease B</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycopeptide capture for cell surface proteomics

Celoppervlakeiwitten, waaronder extracellulaire matrixeiwitten, aan alle belangrijke cellulaire processen en functies, zoals groei, differentiatie en proliferatie. Een uitvoerige karakterisatie van deze eiwitten biedt rijke informatie voor de ontdekking van biomarkers, celtype-identificatie, en drug-target selectie, evenals het helpen om ons begrip van cellulaire biologie en fysiologie te bevorderen. Oppervlakte-eiwitten, echter, vormen belangrijke analytische uitdagingen, vanwege hun inherent lage overvloed, hoge hydrofobiciteit, en zware post-translationele modificaties. Profiterend van de heersende glycosylering op oppervlakte-eiwitten, introduceren we hier een high-throughput glycopeptideresistente capture benadering die de voordelen van een aantal bestaande N-glycoproteoomanalyses middelen integreert. Onze methode kan de glycopeptides afgeleid van oppervlakte-eiwitten te verrijken en te verwijderen van hun glycanen voor facile proteomics via LC-MS. De opgeloste N-glycoproteome omvat de informatie eiwit identiteit en kwantiteit als hun sites van glycosylering. Deze methode is toegepast op een reeks studies in gebieden zoals kanker, stamcellen en druggiftigheid. De beperking van de werkwijze ligt in de geringe hoeveelheden oppervlakte-membraaneiwitten, zodat een relatief grote hoeveelheid monsters is vereist voor deze analyse werden studies gericht op cytosolische eiwitten.

Een representatief stroomschema van de experimentele procedure wordt samengevat in figuur 1. De etikettering en verdere fractionering stappen zijn optioneel en details zijn beschreven in een recente publicatie 18. Een andere optie is om de ongewijzigde peptiden, die niet reageren met de hars te analyseren. De voordelen van het analyseren van de ongewijzigde peptiden zijn de mogelijke identificatie van niet-geglycosyleerde peptiden en proteïnen, zoals Claudins in tight junctions; Een bijkomen...

Watch this Scientific Journal Video about Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics at JoVE.com

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Cel Capture Met behulp van een apparaat Microfluïdische

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Verrijking van extracellulaire matrix eiwitten uit weefsels en de spijsvertering in peptiden voor massaspectrometrie Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...