Name: glycopeptide capture for cell surface proteomics
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00
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이 연구는 사이먼 프레이저 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다.

1. 수확 막 <ol><li> 세포 펠렛 (~ 10 8 셀)에 프로테아제 억제제 칵테일 저장성 버퍼 (10 MM 트리스 - 염산, 10 밀리미터의 KCl, 1.5 mM의 MgCl2를, 산도 8.0)을 추가하고 얼음에 15 ~ 30 분 동안 품어. 를 Lyse 주사기 바늘 (5 ~ 10 패스)를 통해 샘플을 통과하거나 다운스 호모 게 나이저 (15 ~ 30 타)로 샘플을 균질화하여 세포. 용해의 효율을 확인하는 혈구와 트리 판 블루 염색법을 사용합니다. </li><li...

<ol>
	<li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking.">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li><li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane:+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function.">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li><li>White, S. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+(PROSPECTS).">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li><li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis.">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics.">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li><li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation,+immunity,+and+autoimmunity.">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li><li>Dodds, E. 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B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li><li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation.">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li><li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery.">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li><li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells.">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li><li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins.">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells.">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+(gagQP)+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome.">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li></ol>

여기에서 우리는 세포 표면 단백질 프로파일에 대한 글리코 펩타이드 캡처 전략을 소개합니다. 방법은 분비 된 혈액에서와 단백질뿐 아니라 기타 체액 또는 세포 배양 배지에서 연구에 적용될 수있다. 방법의 성공은 샘플의 완전 분해에 의존한다; 따라서 소화 효율의 SDS-PAGE 특성화 특히 시료의 처음 분석을 위해 필요하다. 완전한 소화는 막 단백질에 대한 도전 할 수 있고, ?...

세포 표면 단백질은 세포 외 환경과 상호 작용하는 세포의 외부에서 내부로의 신호를 중계. 따라서, 세포 외 기질 단백질을 포함하여 이러한 단백질은 세포 생물학 및 증식, 성장, 이동, 분화에서 등 노화에 이르기까지 생리학의 모든 측면에서 중요한 역할을한다. 표면 단백질이 다른 세포, 단백질과 작은 분자 1-3와 상호 작용에 의해 작동합니다. 약물의 60 % 이상이 세포 표면 단백질 4를 대상으로하는 등 세포 표면 단백질의 분자 특성은 생물 학자뿐만 아니라, 제약 회사를위한뿐만 아니라 큰 관심입니다. 뛰어난 감도, 정확성 및 단백질과 펩티드의 식별을위한 처리량 텐덤 질량 분석법 (MS)는 글로벌 프로테오믹스 연구 5,6를위한 강력한 도구이다. 그러나, 표면 단백질은, MS-기반 프로테오믹스에 상당한 도전을 제기대부분의 표면 단백질은 낮은 수량과 무거운 수정으로 존재한다. 표면 단백질의 막에 걸친 영역들을 소수성 렌더링; 이것은 특히 다중 경로 막 횡단 단백질에 대한 경우이다. 이 세제의 도움없이 수용액에 막 단백질을 용해하는 것이 곤란하다; 그러나 세제의 사용은 일반적으로 단백질 식별의 HPLC와 MS -1,7,8,8의 성능을 억제한다. 따라서, 막 단백질은 가난 직접 LC-MS 기반 프로테오믹스 특징으로하고 있습니다. 포도당은 세포 표면 단백질 9에서 일어나고있는 가장 중요하고 풍부한 번역 후 변형 중 하나입니다. 글리 칸의 엄청난 복잡성과 이질성은 펩티드 &#39;MS 신호 (10)를 방해. 그럼에도 불구하고, 몇 가지 프로테오믹스 방법은 표면의 단백질을 풍부하게하기 전에 LC-MS 분석에 단백질에서 설탕 부분을 제거하는이 독특한 변형을 사용했다. 이 방법의 렉틴 기반 선호도 캡처 (11)과 하이 드라 지드 기반 또는 붕산 기반 화학 캡처 (12)뿐만 아니라 친수성 크로마토 그래피 분리 8,13 있습니다. 글리 칸의 제거는 일반 단백질에 막 단백질을 변환하고 크게 MS의 특성을 단순화합니다. 당화 또한 단백질 막에 대비 높은 용해도를 분비 단백질에서 발생하기 때문에, 많은 glycoproteomic 방법은 수용성 단백질에 최적화 된 낮은 글리코 펩티드 선택과 단백질 8,14를 막에 배포되는 감도를 갖는 경향이있다. 다른 방법도 풍부하게 존재한다, 특히, 초 원심 분리 (15) 및 라벨 (16) 전략을 사용하는 것과 같은 세포 표면 단백질. 막 단백질의 특성에 대한 우리의 방법과 기존의 방법과 자세한 비교는 최근 17를 실시하고, 그 결과는 우리의 방법이 동일하게 수행 할 수있는 표시, 경우에 없습니다모든 비교 막 단백질 체학 방법보다 더 나은,하지만 더 소박하고. 연구팀은이 방법을 사용하기 위해, 여기에 우리 세부 일반 프로토콜입니다. 이 방법은 기존의 glycoproteomics 전략의 몇 가지 장점을 통합하고 막 당 단백질을 위해 특별히 고안되어, 아직 방법은 분비 단백질을 동일하게 작동합니다. 이 방법의 특징은 1) 막 단백질의 완전한 용해, 2) 대신에 고체 포집 기판을 사용하는 경우 잠재적 인 입체 장해를 제거하는 당 단백질의 글리코 펩타이드의 농축, 3) 하이 드라 지드 화학의 사용은 공유 결합 사이를 형성하도록 글리코 펩타이드와 캡처 기판 접합 글리코 펩타이드가 높은 glycoselectivity 엄격한 세척을 견딜 수 있고, 4) 능력이 감소 샘플 손실 및 단축 절차 기간 동안 하나의 튜브 전체 포착 절차를 수행 할 수 있도록. VARI 연구에이 방법을 실행 한 후세포와 조직 등의 생체 시료 중의 ety, 우리는 당 단백질 8,17,18에 높은 선택성 (&gt; 90 %)을 관찰했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapigest SF</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium periodate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">311448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNGase F</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0704S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Affi-Gel Hz Hydrazide gel</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">153-6047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Worthington Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">LS02115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sep-Pak C-18 cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT054955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor coctail</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:199px;">Amersco</td>
			<td style="width:119px;">568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium sulphite</td>
			<td style="width:199px;">Caledon</td>
			<td style="width:119px;">8360-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Invertase</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alpha-1 trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ribonulease B</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycopeptide capture for cell surface proteomics

세포 외 기질 단백질을 포함한 세포 표면 단백질은, 이러한 성장, 분화, 증식 등의 모든 주요 셀룰러 프로세스 및 기능에 참여합니다. 이 단백질의 포괄적 인 특성은 바이오 마커 발견, 세포 유형 식별 및 약물 표적 선택뿐만 아니라, 세포 생물학 및 생리학에 대한 우리의 이해를 사전에 도움 풍부한 정보를 제공합니다. 표면 단백질은, 그러나, 그들의 본질적으로 낮은 풍부, 소수성, 무거운 번역 후 변형의 중요한 분석 과제를 포즈. 표면 단백질에 널리 당화을 활용, 우리는 여기에 몇 가지 기존의 N-glycoproteomics 수단의 장점을 통합하는 높은 처리량 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다. 우리의 방법은 표면 단백질에서 파생 된 글리코 펩타이드를 풍부하게하고 LC-MS를 사용하여 손쉬운 프로테오믹스에 대한 자신의 글리 칸을 제거 할 수 있습니다. 확인 된 N-glycoproteome는 INF를 포함한다단백질의 정체성과 양뿐만 아니라 포도당의 자신의 사이트의 ormation. 이 방법은 암, 줄기 세포, 약물 독성을 포함한 영역에서 일련의 연구에 적용되어왔다. 방법의 한계는 샘플의 상대적으로 많은 양의 세포질 단백질을 중심으로 연구와 비교하여 본 분석에 필요한되도록 표면 막 단백질의 낮은 풍부에있다.

실험 절차의 대표적인 흐름도는도 1에 요약되어있다. 라벨 및 상기 분류 단계는 선택적이며 상세는 최근 간행물 (18)에 기재되어있다. 또 다른 옵션은 수지와 반응하지 않는 비 변형 펩티드를 분석하는 것이다. 변형되지 않은 펩티드를 분석의 장점은 단단한 접합부에서 claudins 같은 비 - 글리코 실화 된 펩티드 및 단백질의 가능성 식별을 포함한다; 추가적인 장점은보다 정확한...

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Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

세포 표면 단백질은 생물학적으로 중요하고 광범위 글리코 실화이다. 우리는 손쉬운 LC-MS 기반 단백체 분석을 위해이 단백질을 용해 풍부하고 deglycosylate 여기 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다.

세포 표면 단백질 체학 (Proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Microfluidic 장치를 사용하여 셀 캡처

연구

생물학

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