Name: glycopeptide capture for cell surface proteomics
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics at JoVE.com

Denne forskningen har vært støttet av oppstartsfond av Simon Fraser University.

En. Slakte Membraner <ol><li> Legg hypotonisk buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, pH 8,0) med protease inhibitor cocktail på en cellepellet (~ 10 8 celler) og inkuberes i 15-30 minutter på is. Lyse av celler ved å føre prøven gjennom sprøytenåler (5-10 Pass) eller homogenisere prøven ved en Douce-homogenisator (15-30 slag). Bruk et hemocytometer og trypan blå farging for å undersøke effektiviteten av lysis. </li><li> Tak i den mikrosomale fraksjon av en differensialsentrif...

<ol>
	<li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking.">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li><li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane:+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function.">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+dissection+of+membrane+proteins.">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li><li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.+.">Membrane-protein topology. .</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology.">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li><li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+(PROSPECTS).">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li><li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis.">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics.">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li><li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation,+immunity,+and+autoimmunity.">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li><li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions.">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li><li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin+affinity+capture,+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins.">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li><li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation.">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li><li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery.">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li><li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells.">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li><li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins.">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells.">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+(gagQP)+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome.">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li></ol>

Her introduserer vi en glycopeptide-fangst strategi for profilering celle-overflateproteiner. Fremgangsmåten kan brukes til å studere utskilte proteiner, slik som de i blodet samt i andre kroppsvæsker eller i cellekulturmediet. Suksessen til den metoden er avhengig av den komplette fordøyelsen av prøver; Derfor, er en SDS-PAGE karakterisering av fordøyelseseffektivitet nødvendig, spesielt for det første tids analyse av en prøve. En komplett fordøyelse kan være utfordrende for memb...

Celleoverflateproteiner kommuniserer med det ekstracellulære miljø og videresende signaler fra utsiden til innsiden av en celle. Således er disse proteinene, inkludert ekstracellulære matriksproteiner, spiller avgjørende roller i alle aspekter av cellulær biologi og fysiologi som strekker seg fra proliferasjon, vekst, migrering, differensiering til aldring og så videre. Overflateproteiner fungere ved å samhandle med andre celler, proteiner og små molekyler 1-3. Molekylær karakterisering av celle-overflateproteiner er av stor interesse ikke bare for biologer, men også for farmasøytiske selskaper, som mer enn 60% av narkotika er målrettet mot celle-overflateproteiner fire. Tandem massespektrometri (MS), med sin overlegne følsomhet, nøyaktighet og gjennomløp for identifisering av proteiner og peptider, har vært et kraftig verktøy for globale proteomic studier 5,6. Likevel, overflateproteiner utgjøre betydelige utfordringer til MS-baserte proteomikk, somde fleste overflateproteiner finnes i lave mengder og med tunge modifikasjoner. Membran-spenner regioner av overflaten proteiner gjør dem hydrofobe; Dette er særlig tilfelle for multipass transmembrane proteiner. Det er således vanskelig å løse opp membranproteiner i vandige oppløsninger uten hjelp av en detergent; men bruken av vaskemidler generelt undertrykker utførelsen av HPLC og MS 1,7,8 i protein identifikasjon. Derfor har membran proteiner er dårlig karakterisert i direkte LC-MS basert proteomikk. Glykosylering er en av de viktigste og mest rikelig post-translasjonelle modifikasjoner som finner sted i celle-overflateproteiner 9. Den enorme kompleksitet og heterogenitet av glykaner hemme peptider &#39;MS signal 10. Likevel har flere proteomikk metoder brukt denne unike modifisering å berike overflateproteiner og å fjerne sukkerdelene fra proteiner før LC-MS analyse. Disse metodes omfatter lektin-basert affinitet capture 11 og hydrazid-baserte eller borsyre-basert kjemisk capture 12 så vel som hydrofile kromatografiske separasjoner 8,13. Fjerning av glykaner forvandles membran proteiner til vanlige proteiner og drastisk forenkler MS karakterisering. Fordi glykosylering forekommer også i utskilte proteiner som har høy oppløselighet i motsetning til membran proteiner, er mange glycoproteomic metoder optimalisert for løselige proteiner, og har en tendens til å ha lavere glykopeptid selektivitet og følsomhet når det blir utplassert til membran proteiner 8,14. Andre metoder finnes også for å berike, særlig celle-overflateproteiner, slik som de ved hjelp av ultrasentrifugering 15 og merking strategier 16. En detaljert sammenligning mellom vår fremgangsmåte og andre eksisterende metoder for å karakterisere membranproteiner ble utført nylig 17, og resultatene indikerte at vår metode kan utføre like godt, om ikkebedre enn alle de sammenlignede membran proteomikk metoder, men med større enkelhet. For å hjelpe forskere bruker denne metoden, vi detalj her en generell protokoll. Denne fremgangsmåten integrerer flere fordeler på eksisterende glycoproteomics strategier, og er utviklet spesielt for membran-glykoproteiner, men metoden fungerer like godt for utskilte proteiner. Det som kjennetegner denne fremgangsmåten innbefatter: 1) en fullstendig oppløsning av membranproteiner, 2) en berikelse av glykopeptider istedenfor glykoproteiner for å eliminere den potensielle steriske hindring ved bruk av en faststoff fange substrat, 3) ved bruk av kjemi-hydrazid for å danne kovalente bindinger mellom glykopeptider og fange substrat, slik at de bundne glykopeptider tåler høye vaskinger for høy glycoselectivity, og 4) evnen til å utføre hele fangst prosedyren i ett rør for redusert prøvetap og forkortet prosedyre varighet. Etter gjennomføring av denne metoden for å studere en variety av biologiske prøver, inkludert celler og vev, ble det observert en høy selektivitet (&gt; 90%) for å glykoproteiner 8,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapigest SF</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium periodate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">311448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNGase F</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0704S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Affi-Gel Hz Hydrazide gel</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">153-6047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Worthington Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">LS02115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sep-Pak C-18 cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT054955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor coctail</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:199px;">Amersco</td>
			<td style="width:119px;">568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium sulphite</td>
			<td style="width:199px;">Caledon</td>
			<td style="width:119px;">8360-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Invertase</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alpha-1 trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ribonulease B</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycopeptide capture for cell surface proteomics

Celleoverflateproteiner, inkludert ekstracellulære matrix proteiner, delta i alle de store cellulære prosesser og funksjoner, slik som vekst, differensiering og spredning. En omfattende karakterisering av disse proteinene gir fyldig informasjon for biomarkører, celle-type identifikasjon, og narkotika-target utvalg, samt bidra til å fremme vår forståelse av cellebiologi og fysiologi. Overflateproteiner er imidlertid utgjøre betydelige analytiske utfordringer på grunn av deres iboende lave mengde av høy hydrofobisitet, og tunge post-translasjonelle modifikasjoner. Å dra nytte av den rådende glykosylering på overflateproteiner, innfører vi her en høy gjennomstrømming glycopeptide-fangst tilnærming som integrerer fordelene av flere eksisterende N-glycoproteomics midler. Vår metode kan berike glykopeptider utvunnet av overflateproteiner og fjerne sine glykaner for lettvinte proteomikk ved hjelp av LC-MS. Den løst N-glycoproteome omfatter informasjon av protein identitet og kvantitet så vel som sine områder av glykosylering. Denne metoden har vært brukt til en rekke studier i områder, inkludert kreft, stamceller, og narkotika toksisitet. Begrensningen av fremgangsmåten ligger i den lave mengde av overflatemembranproteiner, slik at et relativt stort antall av prøver er nødvendig for denne analyse sammenlignet med studier sentrert på cytosoliske proteiner.

Et representativt flytskjema over den eksperimentelle fremgangsmåten er sammenfattet i figur 1.. Merkingen og ytterligere fraksjone trinn er valgfritt, og detaljer er beskrevet i en nylig publikasjon 18.. Et annet alternativ er å analysere de umodifiserte peptider, som ikke reagerer med harpiksen. Fordelene med å analysere de umodifiserte peptider omfatter den potensielle identifisering av ikke-glykosylerte peptider og proteiner, slik som Claudins i trange veikryss; en ekstra fordel er mer...

Watch this Scientific Journal Video about Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics at JoVE.com

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Celleoverflateproteiner er biologisk viktig og allment glykosylert. Vi introduserer her en glycopeptide-fangst tilnærming til å oppløse, berike, og deglycosylate disse proteinene for lettvinte LC-MS basert proteomikk analyser.

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomikk

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Capture Using a Microfluidic Device

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering av membran proteiner Bruke Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Grådighet-basert Ekstracellulær Interaction Screening (AVEXIS) for Scalable Detection of Low-affinitet ekstracellulære Receptor-ligand interaksjoner

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolsk Merking og Membran Fraksjone for komparativ proteomikk analyser av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension cellekulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound massespektrometri - et kraftig verktøy for å identifisere Novel c-di-GMP Effector Proteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Ikke-enzymatisk, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive brystlesjonene for Spontan generasjon Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Valgt Reaction Monitoring massespektrometri for Absolute Protein Kvantifisering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av Ekstracellulære Matrix Proteiner fra Vev og Fordøyelse inn Peptider for massespektrometrianalyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Surface Sprer og Farging av gjær Kromosomer

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analysere Cell Surface Adhesjon Ombygging i Response til Mekanisk Tension Bruke magnetiske kuler

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...