Name: glycopeptide capture for cell surface proteomics
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00
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Esta pesquisa foi financiada pelo fundo de arranque de Simon Fraser University.

1. Colheita Membranas <ol><li> Adicionar tampão hipotónico (10 mM Tris-HCl, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) com o cocktail inibidor de protease para um agregado de células (~ 10 8 células) e incuba-se durante 15-30 minutos em gelo. Lyse as células por fazer passar a amostra através de agulhas de seringas (5-10 passagens) ou homogeneizar a amostra por um homogeneizador Dounce (15-30 AVC). Use um hemocitômetro e coloração azul de tripan para verificar a eficiência da lise. </li><li> ...

<ol>
	<li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking.">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li><li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane:+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function.">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+dissection+of+membrane+proteins.">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li><li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.+.">Membrane-protein topology. .</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology.">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li><li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+(PROSPECTS).">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li><li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis.">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics.">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li><li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation,+immunity,+and+autoimmunity.">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li><li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions.">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li><li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin+affinity+capture,+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins.">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li><li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation.">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li><li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery.">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li><li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells.">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li><li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins.">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells.">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+(gagQP)+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome.">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li></ol>

Aqui apresentamos uma estratégia de captura de glycopeptide para perfilar as proteínas da superfície celular. O método pode ser aplicado para estudar as proteínas segregadas, tal como aqueles em sangue, assim como em outros fluidos corporais, ou em meios de cultura de células. O sucesso do método que se baseia na digestão completa de amostras; por conseguinte, uma caracterização de SDS-PAGE da eficiência da digestão é necessário, especialmente para a análise pela primeira vez ...

Proteínas da superfície da célula interagir com o ambiente extracelular e transmitir sinais a partir do exterior para o interior de uma célula. Assim, estas proteínas, incluindo proteínas de matriz extracelular, desempenham papéis críticos em todos os aspectos da biologia celular e fisiologia variando de proliferação, o crescimento, a migração, a diferenciação de envelhecimento e assim por diante. Proteínas de superfície de funcionar interagindo com outras células, proteínas e pequenas moléculas 1-3. Caracterização molecular de proteínas da superfície celular, é de grande interesse, não só para os biólogos, mas também para as empresas farmacêuticas, mais do que 60% ​​da droga são dirigidos a proteínas da superfície da célula 4. Espectrometria de massa em tandem (MS), com a sua sensibilidade superior, precisão e rendimento para a identificação de proteínas e peptídeos, tem sido uma ferramenta poderosa para estudos de proteômica globais 5,6. No entanto, as proteínas de superfície representam desafios significativos para proteômica baseada em MS, comoa maioria das proteínas de superfície existe em baixas quantidades, e com modificações pesados. As regiões que atravessam a membrana das proteínas de superfície de torná-los hidrófobos; este é especialmente o caso de proteínas transmembrana multipass. É, portanto, difícil de dissolver as proteínas de membrana em soluções aquosas, sem a ajuda de um detergente; no entanto, o uso de detergentes geralmente suprime o desempenho de HPLC e MS 1,7,8 na identificação de proteínas. Portanto, as proteínas da membrana foram mal caracterizado em proteômica baseada LC-MS diretos. A glicosilação é uma das modificações pós-tradução mais importantes e abundantes que ocorrem em proteínas da superfície das células 9. A enorme complexidade e heterogeneidade dos glicanos dificultar sinal de 10 MS &#39;peptídeos. No entanto, vários métodos proteomic usaram esta modificação única para enriquecer as proteínas de superfície e para remover as porções de açúcar a partir de proteínas antes da análise por LC-MS. Estes métodos incluem baseada em lectina de captura por afinidade e 11 à base de ácido de captura 12 ou químico bórico à base de hidrazida, bem como separações cromatográficas hidrofílicos 8,13. A remoção dos glicanos transforma as proteínas da membrana de proteínas e regulares drasticamente simplifica a caracterização MS. Porque glicosilação também ocorre em proteínas secretadas que têm alta solubilidade em contraste com a membrana proteínas, muitos métodos glycoproteomic são otimizados para proteínas solúveis, e tendem a ter menor seletividade glycopeptide e sensibilidade ao ser implantado para a membrana proteínas 8,14. Outros métodos também existe para o enriquecimento, em particular, as proteínas da superfície celular, tais como aqueles utilizando ultracentrifugação 15 e estratégias de rotulagem 16. Uma comparação detalhada entre o nosso método e outros métodos existentes para a caracterização de proteínas de membrana foi realizada recentemente 17, e os resultados indicaram que o método pode executar igualmente bem, se nãomelhor, do que todos os métodos de comparação proteómica membrana, mas com maior simplicidade. Para ajudar os pesquisadores a utilizar este método, detalhamos aqui um protocolo geral. Este método integra várias vantagens de estratégias glycoproteomics existentes e é concebido especificamente para glicoproteínas de membrana, no entanto, o método funciona igualmente bem para as proteínas secretadas. As características deste método incluem: 1) uma solubilização completa de proteínas de membrana, 2) um enriquecimento de glicopéptidos em vez de glicoproteínas para eliminar o potencial impedimento espacial quando se utiliza um substrato de captura de sólidos, 3) a utilização da química de hidrazida para formar ligações covalentes entre glicopéptidos e o substrato de captura, de modo a que os glicopéptidos ligados tolera lavagens rigorosas para alta glycoselectivity, e 4) a capacidade de realizar o processo de captura de todo em um tubo para a perda de amostra reduzida ea duração do procedimento encurtado. Depois de implementar este método para estudar uma variáveledade de amostras biológicas, incluindo células e tecidos, observou-se uma selectividade elevada (&gt; 90%) às glicoproteínas 8,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapigest SF</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium periodate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">311448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNGase F</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0704S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Affi-Gel Hz Hydrazide gel</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">153-6047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Worthington Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">LS02115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sep-Pak C-18 cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT054955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor coctail</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:199px;">Amersco</td>
			<td style="width:119px;">568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium sulphite</td>
			<td style="width:199px;">Caledon</td>
			<td style="width:119px;">8360-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Invertase</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alpha-1 trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ribonulease B</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycopeptide capture for cell surface proteomics

Proteínas de superfície celular, incluindo as proteínas da matriz extracelular, participam em todos os principais processos e funções celulares, tais como o crescimento, a diferenciação e proliferação. A caracterização detalhada destas proteínas fornece informações ricas para a descoberta de biomarcadores, a identificação do tipo de célula, e seleção-alvo da droga, bem como ajudando a avançar a nossa compreensão da biologia celular e fisiologia. Proteínas de superfície, no entanto, colocam desafios analíticos significativos, devido à sua inerente baixa abundância, alta hidrofobicidade, e pesadas modificações pós-traducionais. Aproveitando a glicosilação em proteínas de superfície predominante, apresentamos aqui uma abordagem de captura de glicopéptido de alto rendimento, que integra as vantagens de vários meios N-glycoproteomics existentes. Nosso método pode enriquecer os glicopeptídeos derivados de proteínas de superfície e remover seus glicanos para proteômica fáceis utilizando LC-MS. A N-glycoproteome resolvido compreende a informação de identidade e quantidade de proteína, bem como os seus locais de glicosilação. Este método foi aplicado a uma série de estudos em diversas áreas, incluindo o cancro, as células estaminais, e a toxicidade da droga. A limitação do método reside na fraca abundância de proteínas de membrana de superfície, de tal modo que uma quantidade relativamente grande de amostras é necessária para esta análise em comparação com estudos centrados em proteínas citosólicas.

Uma carta do procedimento experimental fluxo representativo é resumido na Figura 1. A rotulagem e as novas medidas de fracionamento são opcionais e os detalhes estão descritos em uma publicação recente 18. Uma outra opção é para analisar os péptidos não modificados, que não reagem com a resina. As vantagens da análise dos péptidos não modificados incluem a identificação potencial de peptídeos e proteínas não glicosiladas, tais como claudinas nas junções apertadas; uma van...

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Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

As proteínas de superfície são biologicamente importantes e amplamente glicosilada. Apresentamos aqui uma abordagem de captura de glycopeptide para solubilizar, enriquecer e deglycosylate estas proteínas para análise proteômica baseada LC-MS fáceis.

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