Name: glycopeptide capture for cell surface proteomics
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics at JoVE.com

Это исследование было поддержано запуска фонда Университета Саймона Фрейзера.

1. Harvest Мембраны <ol><li> Добавить гипотонического буфера (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, рН 8,0) с коктейль ингибиторов протеаз на клеточного осадка (~ 10 8 клеток) и инкубируют в течение 15-30 мин на льду. Lyse клетки при прохождении пробы через шприцев игл (5-10 проходов) или гомогенизации о...

<ol>
	<li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking.">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li><li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane:+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function.">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+dissection+of+membrane+proteins.">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li><li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.+.">Membrane-protein topology. .</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology.">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li><li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+(PROSPECTS).">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li><li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis.">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics.">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li><li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation,+immunity,+and+autoimmunity.">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li><li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions.">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li><li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin+affinity+capture,+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins.">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li><li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation.">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li><li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery.">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li><li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells.">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li><li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins.">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells.">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+(gagQP)+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome.">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li></ol>

Здесь мы вводим стратегию гликопептид-захвата для профилирования белков клеточной поверхности. Этот метод может быть применен для изучения секретируемые белки, такие как те в крови, а также в других жидкостей организма или в культуральной среде клеток. Успех метода зав...

Белки клеточной поверхности взаимодействуют с внеклеточной среде и передают сигналы с внешней стороны к внутренней части клетки. Таким образом, эти белки, в том числе белков внеклеточного матрикса, играют важную роль во всех аспектах клеточной биологии и физиологии, начиная от распространения, роста миграции, дифференциации к старению и так далее. Поверхностные белки функционируют за счет взаимодействия с другими клетками, белков и малых молекул 1-3. Молекулярная характеристика белков клеточной поверхности представляет большой интерес не только для биологов, но и для фармацевтических компаний, так как более 60% лекарственных средств направлены на клеточной поверхности белков 4. Тандемной масс-спектрометрии (МС), с превосходной чувствительностью, точностью и пропускной способности для идентификации белков и пептидов, был мощным инструментом для глобальных протеомных исследований 5,6. Тем не менее, поверхностные белки создают значительные проблемы для протеомики MS-основе, каксуществует большинство поверхностные белки в небольших количествах и с тяжелыми изменениями. Мембранные охватывающей регионы поверхностных белков сделать их гидрофобными; это особенно касается многопроходных белков трансмембранных. Таким образом, трудно растворим мембранных белков в водных растворах без помощи моющего средства; Однако использование моющих средств обычно подавляет производительность ВЭЖХ и МС 1,7,8 в идентификации белков. Таким образом, мембранные белки были слабо отличающийся тем, прямых протеомики на основе LC-MS. Гликозилирование является одним из наиболее важных и распространенных пост-трансляционных модификаций, происходящих в белков клеточной поверхности 9. Огромный сложность и неоднородность гликанах препятствовать MS сигнальных пептидов &#39;10. Тем не менее, несколько протеомические методы использовали эту уникальную модификацию обогатить поверхностные белки и удалить остатки сахара из белков до ЖХ-МС анализа. Это методс включить лектина на основе сродства захвата 11 и гидразида на основе борной кислоты или на основе химического захвата 12, а также гидрофильные хроматографии разделения 8,13. Удаление гликанах превращает мембранные белки с обычными белками и резко упрощает MS характеристику. Потому гликозилирования также происходит в секретируемых белков, которые имеют высокую растворимость в отличие от мембранных белков, многие glycoproteomic методы оптимизированы для растворимых белков, и, как правило, имеют более низкий гликопептидам селективности и чувствительности, когда развертывается с мембранными белками 8,14. Другие методы также существуют для обогащения, в частности, белков клеточной поверхности, такие как те, которые используют ультрацентрифугирования 15 и маркировка стратегии 16. Подробное сравнение между нашего метода и других существующих методов для характеристики мембранных белков проводили в последнее 17, и результаты показали, что наш метод может функционировать одинаково хорошо, если нелучше, чем все сравниваемых методов мембранные протеомики, но с более высокой простоты. Чтобы помочь исследователям использовать этот метод, мы здесь подробно общий протокол. Этот метод объединяет несколько преимуществ существующих glycoproteomics стратегий и разработали специально для мембранных гликопротеинов, но метод работает одинаково хорошо для секретируемых белков. Характеристики этого метода включают: 1) полное солюбилизации мембранных белков, 2) обогащение гликопептидов вместо гликопротеинов Для устранения возможности пространственное затруднение при использовании твердого захваченной подложку, 3) использование гидразида химии с образованием ковалентных связей между гликопептиды и захвата подложки, таким образом, что соединенные гликопептиды могут переносить жесткие моет для высокого glycoselectivity и 4) способность проводить всю процедуру захвата в одну трубку для снижения потерь образца и продолжительности укороченной процедуры. После реализации этого метода к изучению с переменнымщества биологических образцов, включая клетки и ткани, мы наблюдали высокую селективность (&gt; 90%), чтобы гликопротеинов 8,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapigest SF</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium periodate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">311448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNGase F</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0704S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Affi-Gel Hz Hydrazide gel</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">153-6047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Worthington Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">LS02115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sep-Pak C-18 cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT054955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor coctail</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:199px;">Amersco</td>
			<td style="width:119px;">568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium sulphite</td>
			<td style="width:199px;">Caledon</td>
			<td style="width:119px;">8360-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Invertase</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alpha-1 trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ribonulease B</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycopeptide capture for cell surface proteomics

Белки клеточной поверхности, в том числе белков внеклеточного матрикса, участвовать во всех крупных клеточных процессов и функций, таких как рост, дифференцировку и пролиферацию. Комплексный характеристика этих белков обеспечивает богатую информацию для поиска биомаркеров, идентификации камерного типа, и выбор лекарственной целевой, а также помогая продвинуть наше понимание клеточной биологии и физиологии. Поверхностные белки, однако, создают значительные аналитические проблемы, из-за их изначально низкой численности, высокой гидрофобностью и тяжелых пост-трансляционных модификаций. Воспользовавшись тем, что распространенной гликозилирования на поверхностных белков, введем здесь высокой пропускной подход гликопептид захвата, которая объединяет в себе преимущества нескольких существующих N-glycoproteomics средств. Наш метод может обогатить гликопептиды, полученные из поверхностных белков и удалить их гликаны для легковесных протеомики с использованием ЖХ-МС. Разрешенный N-glycoproteome включает инфormation идентичности белка и количества, а также их сайтов гликозилирования. Этот метод был применен к серии исследований в областях, в том числе рака, стволовых клеток и токсичности препаратов. Ограничение метода заключается в низкой численности поверхностных мембранных белков, таких, что относительно большое количество образцов, необходимых для проведения такого анализа по сравнению с исследований сосредоточены на цитозольными белков.

Представитель блок-схема экспериментальной процедуры приводится на рисунке 1. Маркировка и дальнейшие шаги фракционирования являются необязательными и детали описаны в недавней публикации 18. Другой вариант заключается в анализе немодифицированных пептидов, которые н...

Watch this Scientific Journal Video about Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics at JoVE.com

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Белки клеточной поверхности являются биологически важной и широко гликозилированный. Введем здесь подход гликопептид захвата для растворения, обогатить и deglycosylate эти белки для легковесных протеомных анализа на основе ЖХ-МС.

Гликопептиды Захват для клеточной поверхности протеомики

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Сотовые Захват Использование микрожидкостных устройств

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Высокая пропускная способность кристаллизации мембранных белков, используя метод липидный Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Алчность на основе взаимодействия внеклеточной скрининга (AVEXIS) для масштабируемых обнаружения низкого сродства внеклеточного рецептор-лиганд

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Метаболический Маркировка и мембраны фракционирования для сравнительного Proteomic Анализ<em&gt; Арабидопсис</em&gt; Подвеска Клеточные культуры

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Захват соединения масс-спектрометрия - мощный инструмент для идентификации новых гр-ди-GMP эффекторных белков

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Неферментативное, сыворотка-бесплатно культуры ткани из Pre-инвазивных поражений груди для самозарождения Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Выбранный мониторинга реакций масс-спектрометрии для абсолютного белка количественной

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Обогащение белков внеклеточного матрикса из тканей и пищеварения в пептидов для анализа масс-спектрометрии

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Поверхность Распространение и Иммуноокрашивание дрожжей хромосом

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Анализ клеточной поверхности адгезии Ремоделирование в ответ на механическое напряжение с помощью магнитных шариков

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...