Name: ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration
Uploaded: 2014-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration at JoVE.com

Le travail a été soutenu par un financement de base du Conseil de recherches médicales. Nous sommes reconnaissants à Craig Nicol pour préparer des dessins techniques. Nous sommes reconnaissants à Matthew Pearson et Paul Perry pour leur soutien d&#39;imagerie.

Tous les travaux des animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles sous licence par le Home Office du Royaume-Uni (numéro de licence du projet PPL 60/3785 et 60/4424). 1. Préparation <ol><li> Étiqueter les mélanoblastes dans la peau en développement en combinant une ligne appropriée recombinase Cre exprimant la souris avec une lignée de souris rapporteur fluorescent. Tyr :: CreA, Tyr :: CREB 8 et Wnt1 :: Cre 14 ont ...

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

Nous décrivons une méthode de culture embryonnaire peau qui est particularité prête à l&#39;imagerie des cellules vivantes sur des microscopes confocaux inversées. Le procédé comprend les améliorations récentes qui permettent 6 cultures à imager en parallèle et supprime le recours à matrigel et membranes Nuclepore de la méthode originale 6. La différence essentielle technique de techniques similaires est l&#39;utilisation d&#39;une membrane perméable aux gaz lourdaud pour établir une interfac...

Traditionnellement peau embryonnaire a été cultivée en disséquant de l&#39;embryon de souris et de montage sur une membrane en polycarbonate Nuclepore. La membrane est ensuite introduit sur ​​un milieu de culture, en maintenant ainsi une interface air-liquide sur la surface du tissu en développement 3,4. Cette technique a été utilisée pour analyser le comportement mélanoblaste en fixant le tissu et l&#39;évaluation de la distribution en utilisant mélanoblaste β-galactosidase en tant que marqueur 7. Nous avons développé une méthode qui permet mélanoblastes live-imagerie de fluorescence marqués en culture ex vivo de la peau 6. Ici, nous décrivons la méthode en détail de dissection, de configuration, de vivre l&#39;imagerie confocale et incluons certaines améliorations récentes. Mélanoblastes sont les précurseurs embryonnaires des mélanocytes, les cellules qui produisent le pigment dans les cheveux et la peau. Mélanoblastes se posent dans la crête neurale à côté du tube neural pendant la journée autour embryonnaire 9 (E9) chez la souris e développementmbryo. Par la suite, ils migrent le long d&#39;une voie dorsolatéral entre l&#39;ectoderme et les somites développement. A E12.5 ils se déplacent du derme à l&#39;épiderme où ils prolifèrent et continuent leur migration. Le motif de follicule pileux primaire commence à se former dans l&#39;épiderme à E14.5 et E15.5 par mélanoblastes sont à localiser ces follicules. Pour une analyse de l&#39;évolution mélanoblaste / mélanocytes voir Thomas &amp; Erickson (2008) 1. Afin de marquer la population mélanoblaste nous avons combiné Tyr :: CREB animaux qui expriment la Cre-recombinase dirigée par le promoteur de la tyrosinase de la souris avec 8 animaux R26YFPR qui expriment la protéine fluorescente jaune (YFP), conditionnellement à partir du locus ROSA26 9. Nous décrivons un procédé de culture d&#39;embryons images de la peau et de saisie à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal inversé. Il est adapté sous forme de la méthode originale décrite dans Mort et al. (2010) 6. La présenteméthode permet l&#39;imagerie dans un format de 6 puits et élimine le recours à des membranes Nuclepore et sur matrigel à soutenir la culture. Au lieu de cela à l&#39;aide d&#39;un petit bloc d&#39;agarose à 1% pour stabiliser la peau embryonnaire. Retrait de la dépendance à l&#39;égard matrigel est particulièrement important dans les cas où la réponse de la peau embryonnaire à des facteurs de croissance solubles est l&#39;objet d&#39;étude. Notre méthode originale a déjà été utilisé pour acquérir de nouvelles connaissances dans le développement de mélanoblaste 10-13 et nous prévoyons que les améliorations que nous décrivons ici, il sera plus puissant qu&#39;une technique expérimentale en particulier lorsque plusieurs cultures parallèles sont une exigence.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Mélanoblastes sont la crête neurale précurseurs de mélanocytes dérivés; les cellules responsables de la production du pigment dans la peau et les cheveux. Mélanoblastes migrent à travers l&#39;épiderme de l&#39;embryon où elles colonisent ensuite le développement de follicules de cheveux de 1,2. La migration des cellules de la crête neurale est largement étudiée in vitro, mais les méthodes in vivo ne sont pas encore bien développée, surtout dans les systèmes mammifères. Une alternative est d&#39;utiliser culture ex vivo organotypique 3-6. Culture de peau embryonnaire de la souris nécessite le maintien d&#39;une interface air-liquide (ALI) à travers la surface du tissu de 3,6. Haute résolution live-imagerie de la peau embryonnaire de la souris a été entravée par l&#39;absence d&#39;une bonne méthode qui maintient non seulement ce ALI mais permet aussi la culture à être inversée et donc compatible avec courte distance de travail lentilles de l&#39;objectif et des microscopes les plus confocale. Cet article décrit les améliorations récentes à une méthod qui utilise une membrane perméable aux gaz pour surmonter ces problèmes et de permettre à haute résolution de l&#39;imagerie confocale peau embryonnaire en culture ex vivo 6. En utilisant un mélanoblaste Cre recombinase spécifique exprimant lignée de souris combinée avec la ligne de reporter R26YFPR nous sommes en mesure de marquer par fluorescence la population mélanoblaste dans ces cultures de la peau. Cette technique permet de live-imagerie de mélanoblastes et l&#39;observation de leur comportement et les interactions avec le tissu dans lequel elles se développent. Les résultats représentatifs sont inclus pour démontrer la capacité de vivre-image 6 cultures en parallèle.

La figure 2 montre des résultats représentatifs d&#39;une expérience de laps de temps à l&#39;aide de la peau embryonnaire de Tyr :: CREB x embryons R26YFPR à E14.5. 6 cultures embryonnaires de la peau ont été imagées par microscopie confocale toutes les 2 min pendant 18 heures. Le progiciel d&#39;analyse d&#39;image ImageJ freeware a été utilisé pour analyser le comportement des mélanoblastes YFP marqués dans les 6 films. Les mélanoblastes étaient détectés automatique...

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Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Nous décrivons la dissection et la culture ex vivo de peau embryonnaire de la souris. Le système de culture maintient une interface air-liquide sur la surface du tissu et permet une imagerie sur un microscope inversé. Mélanoblastes, une composante de la peau en développement, sont marqué par fluorescence permettant leur comportement à observer par microscopie confocale.

Ex vivo Culture de la peau de souris embryonnaires et Live-imagerie de la migration mélanoblaste

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