Name: ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration
Uploaded: 2014-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration at JoVE.com

Il lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di base del Medical Research Council. Siamo grati a Craig Nicol per la preparazione di disegni tecnici. Siamo grati a Matthew Pearson e Paul Perry per il loro sostegno imaging.

Tutto il lavoro animale è stato eseguito in conformità con le linee guida istituzionali su licenza dalla UK Home Office (numero di licenza del progetto PPL 60/3785 e 60/4424). 1. Preparazione <ol><li> Etichettare le melanoblasts della pelle di sviluppo combinando una linea di topi che esprimono Cre-ricombinasi appropriata con una linea di topi reporter fluorescente. Tyr :: CREA, Tyr :: CREB 8 e Wnt1 :: Cre 14 sono stati utilizzati con successo come...

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

Descriviamo un metodo per la cultura pelle embrionale che è particolarità suscettibili di imaging per il live-cell su microscopi confocale invertiti. Il metodo include i recenti miglioramenti che permettono di 6 culture di essere ripreso in parallelo e rimuove la dipendenza matrigel e membrane Nuclepore del metodo originale 6. La differenza fondamentale tecnico da tecniche simili è l&#39;uso di una membrana permeabile ai gas lummox stabilire un&#39;interfaccia liquido aria e anche agire come un coprioggett...

Tradizionalmente pelle embrionale è stato coltivate sezionando dall&#39;embrione mouse e montaggio su Nuclepore membrana di policarbonato. La membrana viene poi collocato sul mezzo di coltura, mantenendo così una interfaccia aria-liquido sulla superficie del tessuto sviluppo 3,4. Questa tecnica è stata utilizzata per saggiare il comportamento melanoblast fissando il tessuto e valutare la distribuzione melanoblast con β-galattosidasi come marcatore 7. Abbiamo sviluppato un metodo che permette melanoblasts live-imaging fluorescente in ex vivo della cultura pelle 6. Qui si descrive il metodo in dettaglio da dissezione, per l&#39;installazione, per vivere confocale e comprende alcuni recenti miglioramenti. Melanoblasts sono i precursori embrionali dei melanociti, le cellule che producono pigmento nei capelli e la pelle. Melanoblasts sorgono nella cresta neurale adiacente al tubo neurale intorno al giorno embrionale 9 (E9) nel topo sviluppo embryo. Successivamente migrano lungo un percorso dorsolaterale tra l&#39;ectoderma e somiti in via di sviluppo. A E12.5 si muovono dal derma all&#39;epidermide dove proliferano e continuano la loro migrazione. Il follicolo capelli modello primario comincia a formarsi nell&#39;epidermide a E14.5 e E15.5 melanoblasts sono la localizzazione di questi follicoli. Per una rassegna di sviluppo melanoblast / melanociti vedere Thomas &amp; Erickson (2008) 1. Per etichettare la popolazione melanoblast abbiamo combinato Tyr :: CREB animali che esprimono Cre-ricombinasi guidata dal promotore del mouse tirosinasi 8 con animali R26YFPR che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) condizionalmente dal locus Rosa26 9. Descriviamo un metodo per la cultura della pelle e catturare le immagini embrionali utilizzando un microscopio confocale invertito. E &#39;adatta forma il metodo originale descritto in Mort et al. (2010) 6. L&#39;attualemetodo permette l&#39;imaging in un formato da 6 pozzetti e rimuove la dipendenza membrane Nuclepore e matrigel a sostenere la cultura. Invece utilizzando un piccolo blocco di 1% agarosio per stabilizzare la pelle embrionale. Eliminare la dipendenza matrigel è importante soprattutto in situazioni in cui la risposta della pelle embrionale di fattori di crescita solubili è al centro di studio. Il nostro metodo originale è già stato utilizzato per acquisire nuove conoscenze in sviluppo melanoblast 10-13 e ci aspettiamo che i miglioramenti descriviamo qui renderà più potente come una tecnica sperimentale specialmente dove più culture parallele sono un requisito.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Melanoblasts sono cresta neurale precursori dei melanociti derivati; le cellule responsabili della produzione del pigmento nella pelle e dei capelli. Melanoblasts migrano attraverso l&#39;epidermide dell&#39;embrione dove successivamente si colonizzano i capelli sviluppare follicoli 1,2. Migrazione neurale delle cellule cresta è ampiamente studiato in vitro, ma in vivo non sono ancora ben sviluppati, soprattutto nei sistemi mammiferi. Una alternativa è quella di utilizzare ex vivo della cultura organotipica 3-6. Cultura di topo pelle embrionale richiede il mantenimento di una interfaccia aria-liquido (ALI) sulla superficie del tessuto 3,6. Alta risoluzione live-imaging topo pelle embrionali è stata ostacolata dalla mancanza di un buon metodo che non solo mantiene questo ALI ma permette anche la cultura di invertire e quindi compatibile con lenti dell&#39;obiettivo a breve distanza di lavoro e microscopi più confocale. Questo articolo descrive i recenti miglioramenti ad un method che utilizza una membrana permeabile ai gas per superare questi problemi e permettere ad alta risoluzione confocale di pelle embrionale in coltura ex vivo 6. Utilizzando un melanoblast specifico Cre-ricombinasi esprimendo linea di topi in combinazione con la linea giornalista R26YFPR siamo in grado di etichettare fluorescente popolazione melanoblast all&#39;interno di queste culture pelle. La tecnica consente live-imaging melanoblasts e osservazione del loro comportamento e le interazioni con il tessuto in cui si sviluppano. Risultati rappresentativi sono inclusi per dimostrare la capacità di vivere-image 6 culture in parallelo.

La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi di un esperimento lasso di tempo con la pelle embrionale da Tyr :: CREB x embrioni R26YFPR a E14.5. 6 colture pelle embrionali sono stati ripresi dalla microscopia confocale ogni 2 min per 18 ore. Il pacchetto software di analisi delle immagini ImageJ del freeware è stato utilizzato per analizzare il comportamento dei melanoblasts YFP-etichettati nei 6 film. I melanoblasts erano tracciati automaticamente utilizzando il plugin wrMTrck svil...

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Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Descriviamo la dissezione e ex vivo della cultura di topo pelle embrionale. Il sistema di coltura mantiene un&#39;interfaccia aria-liquido attraverso la superficie del tessuto e permette l&#39;imaging su un microscopio invertito. Melanoblasts, un componente della pelle in via di sviluppo, sono fluorescente permettendo loro comportamento da osservare mediante microscopia confocale.

Ex vivo Cultura embrionali di topo della pelle e live-imaging delle Migrazioni Melanoblast

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