Name: ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration
Uploaded: 2014-05-19T14:45:00
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이 연구는 의학 연구위원회에서 핵심 기금에 의해 지원되었다. 우리는 기술 도면을 준비 크레이그 니콜에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 그들의 영상 지원을위한 마태 복음 피어슨와 폴 페리에게 감사의 말씀을 전합니다.

모든 동물의 작업은 영국 홈 오피스 (프로젝트 라이센스 번호 PPL 3천7백85분의 60 및 4천4백24분의 60)에 의해 라이센스하에 제도적 지침에 따라 수행 하였다. 1. 준비 <ol><li> 형광 기자 마우스 라인과 적절한 크레-재조합 효소 발현하는 마우스 라인을 결합하여 개발 피부에 melanoblasts 레이블을 지정합니다. 티르 :: CREA, 티르 :: CREB 8 Wnt1의 :: 크레 (14) ...

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

우리는 거꾸로 공 초점 현미경에하는 라이브 세포 이미징 의무 특수성이다 문화 배아 피부에하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 6 문화가 병렬로 몇 군데 리겔 원래의 방법 (6)의 뉴 클레오 포어 막에 대한 의존도를 제거 할 수 있도록 최근의 개선 사항이 포함되어 있습니다. 유사한 기술에서 중요한 기술적 인 차이는 공기 액체 계면을 확립하고 또한 커버 슬립 역할을 가스 투과성 움직임?...

전통적으로 배아 피부는 마우스 배아에서 해부와 폴리 카보네이트 (polycarbonate) 뉴 클레오 포어 막에 장착하여 배양하고있다. 멤브레인이어서 따라서 현상 3,4 조직의 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지 배지에 부유된다. 이 기술은 조직을 고정하고 마커 7로 β-갈 락토시다 아제를 사용하여 melanoblast 분포를 평가하여 melanoblast 동작을 분석 실험하는 데 사용되었습니다. 우리는 생체 피부의 문화 6 라이브 영상의 형광 표지 melanoblasts 수있는 방법을 개발했습니다. 여기에서 우리는 공 촛점 이미징을 살고, 설정에, 해부에서 세부 방법을 설명하고 최근의 일부 개선을 포함한다. Melanoblasts은 멜라닌 세포의 배아 전구체, 머리와 피부에 색소를 생산하는 세포입니다. Melanoblasts는 개발 마우스 전자에서 배아 일 9 (E9) 주위에 신경 튜브에 인접한 신경 능선에서 발생mbryo. 그 후 그들은 외배엽 및 개발 somites 사이의 dorsolateral 경로를 따라 이동한다. E12.5에서 그들은 증식과 그들의 이동을 계속 표피 진피에서 이동합니다. 기본 모낭 패턴이 모공을 지역화하는 E14.5에서 표피와 E15.5의 melanoblasts에 의해 형성하기 시작합니다. melanoblast / 멜라닌 세포 개발의 검토를 위해 토마스 에릭슨 (2008) 1을 참조하십시오. melanoblast 인구 레이블을하기 위해 우리는 티르를 결합했다 :: 조건부 ROSA26 궤적 9에서 노란색 형광 단백질 (YFP)을 표현 R26YFPR 동물과 마우스 티로시나 아제 프로모터 (8)에 의해 구동 크레-재조합 효소를 표현 CREB 동물. 우리는 거꾸로 공 초점 현미경을 사용하여 문화 배아 피부와 캡처 이미지를하는 방법을 설명합니다. 그것은 모트 등의 설명 원래의 방법. (2010) 6 형태로 구성된다. 본방법은 6 자 형식으로 영상을 허용하고 문화를 지원하는 뉴 클레오 포어 막에와 리겔에 대한 의존도를 제거합니다. 대신 배아 피부를 안정화하는 1 % 아가로 오스의 소 블록을 사용. 마트 리겔에 대한 의존도를 제거하면, 특히 수용성 성장 인자에 대한 배아 피부의 반응이 연구의 초점이 상황에서 중요하다. 우리의 원래 방법은 이미 melanoblast 개발 10-13에 새로운 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다 그리고 우리는 우리가 여기에서 설명하는 개선이 다수의 병렬 문화가 요구 사항, 특히 실험적인 기술로 더 강력 할 것으로 예상.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Melanoblasts은 멜라닌 세포의 전구체를 파생 신경 문장이다; 피부와 머리카락의 색소를 생산에 대한 책임 세포. Melanoblasts는 이후에 개발 머리가 1,2 여포 식민지 배의 표피를 통해 마이그레이션 할 수 있습니다. 신경 능선 세포의 이동은 광범위하게 체외에서 연구되고 있지만, 생체 내 방법을 아직 잘 특히 포유류의 시스템에서 개발되지 않습니다. 하나의 대안은 생체의 Organotypic 문화 3-6을 사용하는 것입니다. 마우스 배아 피부 배양 조직 3,6의 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면 (ALI)의 유지 보수를 필요로한다. 마우스 배아 피부의 고해상도 라이브 영상이 ALI를 유지뿐만 아니라 문화가 반전 짧은 작동 거리 대물 렌즈와 대부분의 공 초점 현미경 따라서 호환 할 수 있습니다뿐만 아니라 좋은 방법의 부족에 의해 방해되었다. 이 문서에서는 메타에 최신의 향상된 기능에 대해 설명합니다OD 즉, 이러한 문제점을 극복하고 생체 외 배양 6 배아 피부의 고해상도 촛점 이미징을 허용하는 가스 투과 막을 사용한다. melanoblast 특정 크레-재조합 효소가 R26YFPR 기자 라인과 함께 마우스 라인을 표현을 사용함으로써 우리는 형광이 피부의 문화 내에서 melanoblast 인구 레이블을 할 수 있습니다. 이 기술은 수 melanoblasts 자신의 행동과 그들이 개발하는 조직과의 상호 작용을 관찰의 라이브 영상. 대표 결과는 사양에 라이브 이미지를 병렬로 6 문화를 보여주기 위해 포함되어 있습니다.

그림 2는 티르에서 배아의 피부를 사용하여 시간 경과 실험에서 대표적인 결과를 보여줍니다 :: CREB는 E14.5에서 R26YFPR 배아를 x. 6 배아 피부의 문화는 18 시간 동안 매 2 분 공 초점 현미경으로 몇 군데 있었다. 프리웨어 이미지 분석 소프트웨어 패키지는 ImageJ에 6 영화 YFP - 표지 melanoblasts의 행동을 분석하는데 사용 하였다. melanoblasts 자동 (제스퍼 Søndergaard이 페더슨?...

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Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

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JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

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