Name: ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration
Uploaded: 2014-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration at JoVE.com

Iş Tıbbi Araştırma Konseyi çekirdek fon tarafından desteklenmiştir. Biz teknik çizimlerini hazırlamak için Craig Nicol minnettarız. Biz onların görüntüleme desteği için Matthew Pearson ve Paul Perry minnettarız.

Tüm hayvan çalışmaları İngiltere Home Office (proje lisans numarası PPL 60/3785 ve 60/4424) tarafından lisans altında kurumsal kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1.. Hazırlık <ol><li> Bir flüoresan raportör fare hattı ile, uygun bir Cre rekombinaz-sentezleyen fare hattını birleştirerek gelişmekte olan deride Melanoblastlardan etiketleyin. Tyr :: CREA, Tyr :: CREB 8 ve Wnt1 :: Cre 14 Cre-ifade eden çizgiler olarak ba...

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

Biz ters konfokal mikroskoplar üzerinde canlı hücre görüntüleme müsait özellıgıdır kültür embriyonik cilt için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemi 6 kültürler paralel olarak görüntülü ve matrigel ve orijinal yönteme 6 Nüklepor zarlar üzerindeki güveni ortadan kaldırır izin son iyileştirmeler içerir. Benzer tekniklerinden önemli teknik bir fark, bir hava arayüzü sıvı kurmak için ve aynı zamanda bir lamel olarak hareket için bir gaz-geçirgen zarın lummox kullanılması...

Geleneksel olarak embriyonik cilt fare embriyo kesme ve bir polikarbonat Nuclepore zar üzerinde monte edilmesi ile kültive edilmiştir. Zar sonra bu şekilde gelişen doku 3,4 yüzeyine karşı bir hava-sıvı arayüz muhafaza, kültür ortamı üzerinde perdahlanır. Bu teknik, sabitleme ve doku bir işaretleyici 7 olarak β-galaktosidaz kullanan melanoblast dağıtım değerlendirerek melanoblast davranışı analiz etmek için kullanılmıştır. Ex vivo deri kültürü 6 canlı görüntüleme bölgesinin floresanla işaretlenmiş Melanoblastlardan izin veren bir yöntem geliştirdik. Burada konfokal görüntüleme yaşamak için, kurulum, diseksiyonu ayrıntılı yöntemini açıklamak ve bazı yeni geliştirmeler içerir. Melanoblastlardan melanosit embriyonik öncüleri, saç ve deri pigment üreten hücrelerdir. Melanoblastlardan gelişmekte olan fare e embriyonik gün 9 (E9) civarında nöral tüp bitişik olarak ortaya çıkan nöralmbryo. Daha sonra bunlar ektoderm ve gelişen Somitlerin arasında bir Dorsolateral yol boyunca göç ederler. E12.5 onlar çoğalırlar ve onların göç devam epidermis dermis taşımak. Birincil saç folikülü model bu köklerinin lokalize olan E14.5 de epidermis ve E15.5 Melanoblastlardan ile oluşmaya başlar. Melanoblast / melanosit gelişme gözden Thomas ve Erickson (2008) 1 bkz. Melanoblast nüfusu etiketlemek için biz Tyr kombine :: şartlı ROSA26 mahaline 9 sarı floresan protein (YFP) ifade R26YFPR hayvan fare tyrosinase promoter 8 ile tahrik Kre-recombinase ifade CREB&#39;ye hayvanlar. Biz ters bir konfokal mikroskop kullanılarak kültür embriyonik deri ve yakalama görüntüleri bir yöntem açıklanmaktadır. Bu Mort et al, orijinal bir yöntem. (2010) 6 bir şekilde uyarlanmıştır. Şimdikiyöntem, 6-çukurlu formatta görüntüleme sağlar ve kültür desteklemek için, Nüklepor dokularından ve Matrigel üzerinde güven kaldırır. Bunun yerine embriyonik cildi dengelemek için% 1 agaroz küçük bir blok kullanarak. Matrigel üzerinde güven çıkarılması özellikle çözünür büyüme faktörlerine embriyonik derinin cevap çalışmasında odağı olduğu durumlarda önemlidir. Bizim orijinal yöntem zaten melanoblast gelişme 10-13 içine yeni anlayışlar kazanmak için kullanılır olmuştur ve biz burada açıklamak gelişmeler çoklu paralel kültürler bir gereklilik özellikle deneysel bir teknik olarak daha güçlü olmasını bekliyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Melanoblastlardan melanosit öncülerini türetilmiş nöral crest; cilt ve saç pigmenti üretmekten sorumlu hücreler. Melanoblastlardan bunlar daha sonra gelişmekte olan saç köklerinin 1,2 kolonize embriyonun epidermis içinden yer değiştirmektedir. Nöral krest hücre göçü yoğun in vitro çalışılmıştır ancak in vivo yöntemlere yine de özellikle memeli sistemlerinde, gelişmiş değildir. Bir alternatif ex vivo organotipik kültürü 3-6 kullanmaktır. Fare embriyonik deri Kültür 3,6 doku yüzeyi boyunca bir hava-sıvı arayüzü (ALI) içinde bakım gerektirir. Fare embriyonik deri yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme Bu ALI korur ama aynı zamanda kültür ters ve kısa çalışma mesafesi objektif lens ve en konfokal mikroskoplar ile bu nedenle uyumlu sağlar değil, sadece iyi bir yöntem olmaması engel olmuştur. Bu makalede, bir meth son gelişmeleri anlatırod ki, bu sorunların üstesinden gelmek ve ex vivo kültür 6 embriyonik deri yüksek çözünürlüklü confocal görüntüleme sağlamak için gaz geçirgen bir zar kullanılır. Belirli bir melanoblast Kre-rekombinaz, R26YFPR raportör hattı ile birleştirilmiş fare hattı sentezleyen kullanarak biz flüoresan bu cilt kültürleri içinde melanoblast nüfus etiket edebiliyoruz. Teknik sağlar Melanoblastlardan ve onların davranış ve geliştirmek hangi doku ile etkileşimleri gözlem canlı görüntüleme. Temsilcisi sonuçları yeteneği canlı görüntü paralel olarak 6 kültürleri göstermek için dahil edilmiştir.

Şekil 2 Tyr&#39;den embriyonik cilt kullanarak bir zaman atlamalı deney temsilcisi sonuçlarını gösterir :: CREB&#39;ye E14.5 de R26YFPR embriyolar x. 6 embriyonik cilt kültürleri 18 saat boyunca her 2 dakikada eş odaklı mikroskopi ile görüntülenmiştir. Ücretsiz görüntü analizi yazılımı paketi İmageJ 6 filmlerde YFP etiketli Melanoblastlardan davranışını analiz etmek için kullanıldı. Melanoblastlardan otomatik olarak (Jesper Søndergaard Pe...

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration at JoVE.com

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Biz fare embriyonik deri diseksiyonu ve ex vivo kültürünü açıklamak. Kültür sistemi doku yüzeyi boyunca bir hava-sıvı arayüz korur ve bir ters mikroskop görüntüleme sağlar. Melanoblastlardan, gelişmekte olan derinin bir bileşeni olarak, flüoresan olarak davranışları konfokal mikroskopi kullanılarak gözlemlenebilir izin etiketlenir.

Fare Embriyonik Cilt ve Melanoblast Göç Canlı görüntüleme ex vivo Kültür

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...