Name: isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy
Uploaded: 2014-05-21T14:00:00
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Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute Zuschuss HL-36573 unterstützt. Wir danken Herrn David Sowa für die Bearbeitung dieses Manuskript.

Alle Forschung an Mäusen wurde nach Verfahren und Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt, und die Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Toledo, Hochschule für Medizin und Lebenswissenschaften genehmigt. 1. Perfusionssystem Vorbereitung <ol><li> Der Tag vor der Isolierung, füllen die gesamte Durchblutung System (einschließlich Stauseen) mit einer Lösung von alkalischen schnell rückstandsfreie Reinigungsmittel...

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	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. 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Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Für die beste Vorbereitung, sind die wichtigsten Schritte: 1) unverzüglich Anschließen der Maus Herz mit der Kanüle nach der Exzision; 2) geeignete Herzdurchblutung. Beachten Sie auch, dass die Wasserqualität, die Durchblutung Temperatur, pH-Puffer, Sterilisation, chemische Reinheit und sauber, nicht kontaminierte Rohre und Kammern sind ebenfalls wichtige Faktoren. 18,2 mOhm Molekularbiologie-Grade-H 2 O ist sehr für Puffer Vorbereitung empfohlen. Der pH-Wert von 200 mM ATP Stammlösung sollte auf 7,2, ein Schritt, der leic...

Kardiomyozyten sind nicht proliferativen. Es gibt einige atrialen Kardiomyozyten-Zelllinien, wie HL-1 und AT-1 Zellen von Maus Vorhof Tumoren abgeleitet sind; jedoch gibt es keine Erwachsenen ventrikulären Kardiomyozyten Zelllinien für die Forschung zur Verfügung. Primärzellkulturen von adulten Maus Kardiomyozyten eine leistungsstarke Modell für Herzforschung auf zellulärer und molekularer Ebene. Bisher sie weitgehend für biochemische, physiologische und pharmakologische Forschung 1 verwendet wurden. Darüber hinaus hat die häufige Verwendung von genetisch veränderten Mäusen effektive Methoden der Kardiomyozyten-Isolation notwendig. Kultur pur ermöglicht Bedingungen frei von Wechselwirkungen mit anderen Organen und den systemischen Kreislauf, zB durch endogene neurohormonalen und hormonähnlichen Faktoren 2,3. Allerdings kann erfolgreiche Isolierung von Kardiomyozyten Herausforderung sein. Das Protokoll wir hier vorstellen wird auf unseren Erfahrungen mit erwachsenen Ratte cardiomyocyt Basisn und die von O&#39;Connell et al 4,5 beschriebenen Methode. Vor allem im Jahr 2007 5 beschrieben sie detaillierte Techniken aus Puffer Vorbereitungen zur Zellkultur-und Funktionstest. Seit Muskelzellen der Maus sind sehr anfällig für Kontraktur im Vergleich zu den Ratten-Herzmuskelzellen, werden die Puffer oder Medien für die Durchblutung, Verdauung, Ca 2 + Duldung, Beschichtung und Kultur in der Maus-Protokoll verwendet, mit einer unspezifischen Erregung und Kontraktion Kopplung Inhibitor, 2 ergänzt, 3-Butandion Monoxim (BDM), um ihre spontane Kontraktion hemmen, daher die Rentabilität und den Ertrag von stabförmigen Muskelzellen deutlich verbessern. In der hier vorgestellten Protokoll werden die Muskelzellen in einem hohen Kalium-Puffer aus dem isolierten Herzen durch modifizierte Langendorff-Perfusion mit Kollagenase Typ II getrennt. Collagenase II effektiv bricht die interzelluläre Matrix und gibt Zellen. Die Perfusion Lösung hält auch den Zellstoffwechsel auf niedrigem Niveau 6. In additiauf das isolierte Herz System von Harvard Apparatus verwendeten wir hier für eine präzise Temperatur-und Konstantdruckregelung 7 gut entwickelt. Dieser Ansatz bietet hoch reproduzierbare und gleichmäßige Zubereitungen Populationen Zelltyp, der in Übernachtkultur zum Messen Signalproteine ​​oder 2-3 Tage alten Kultur für Herzhypertrophie Assays verwendet werden können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

Technologische Fortschritte haben genetisch veränderte Mäuse, einschließlich transgener und Gen-Knockout-Mäusen, ein wesentliches Instrument in vielen Forschungsfeldern. Adulte Kardiomyozyten sind weit verbreitet als ein gutes Modell für die Herzzellphysiologie und Pathophysiologie sowie für pharmazeutische Intervention angenommen. Genetisch veränderte Mäuse, schließen die Notwendigkeit für komplizierte Kardiomyozyten Infektionsprozessen, um den gewünschten Genotyp, was ineffizient aufgrund der terminalen Differenzierung Kardiomyozyten &#39;sind zu generieren. Isolation und Kultur von hoher Quantität und Qualität funktionellen Kardiomyozyten wird dramatisch profitieren Herz-Kreislaufforschung und ein wichtiges Instrument für die Zellsignalübertragung Forschung und Wirkstoffentwicklung. Hier beschreiben wir eine gut etablierte Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus, die mit wenig Training umgesetzt werden können. Die Maus Herz herausgeschnitten und zu einem isolierten Herzsystem Kanüle, dann mit einem Calcium-frei und hoch p blutetenotassium Puffer, gefolgt von Typ-II-Kollagenase-Verdauung im Langendorff-Modus retrograde Perfusion. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Sammlung von Funktions erwachsenen Maus Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

1. Erfolgreiche Isolation Quantifizierung Zwei Kriterien werden verwendet, um den Erfolg der Isolation zu quantifizieren: erstens, die Gesamtzahl der Kardiomyozyten isoliert, und zweitens, das Verhältnis von stabförmigen Calcium-tolerant zu runden nicht tolerant Muskelzellen. Generell dieses Protokoll dauert etwa 75-90 min von Herzen Entfernung zu myocyte Beschichtung und Erträge rund 1 Mio. stabförmigen Kardiomyozyten (70-90% der Gesamt geerntet Muskelzellen) von einer erwachsenen Maus Her...

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Forschung

Biologie

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...