Name: isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy
Uploaded: 2014-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי לאומי ללב, ריאות ודם מכון גרנט HL-36,573. אנו מודים למר דוד Sowa לעריכת כתב היד הזה.

כל המחקר על עכברים שנעשה על פי נהלים והנחיות של המכון הלאומי לבריאות, והפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טולדו, המכללה לרפואה ומדעי חיים. 1. הכנת מערכת זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li styl...

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies.">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).</li><li>Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+and+methods.">Cell culture models and methods.</a> Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).</li><li>Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+working+heart.">The working heart.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamic+instability+and+wavelength+in+arrhythmia+maintenance+as+revealed+by+panoramic+imaging+with+blebbistatin+vs.+2,3-butanedione+monoxime.">The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).</li><li>Liu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+Na/K-ATPase+potentiates+Marinobufagenin-induced+cardiac+dysfunction+and+myocyte+apoptosis.">Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

לעריכה הטובה ביותר, השלבים הקריטיים ביותר הם: 1) מייד משדלת את לב העכבר לצינורית לאחר כריתה; 2) זלוף לב המתאים. כמו כן, שימו לב כי איכות מים, טמפרטורת זלוף, ה-pH של חיץ, עיקור, טוהר כימי, וצינורות נקיים, שאינו מזוהם ותאים הם גם גורמים חשובים. 18.2 mΩ H כיתה ביולוגיה המולקולרי 2 O מומלץ ?...

שריר לב הוא לא שגשוג. יש כמה שורות תאי cardiomyocyte פרוזדורים, כמו HL-1 ו-AT-1 תאים שמקורם בגידולי פרוזדורי עכבר; עם זאת, אין קווים סלולריים cardiomyocyte חדרית המבוגר זמינים למחקר. תרביות תאים ראשוניות של שריר לב עכבר מבוגר לספק מודל רב עוצמה למחקר לב ברמה התאית ומולקולרית. עד כה, הם היו בשימוש נרחב למחקר ביוכימי, פיסיולוגי, ותרופתי 1. בנוסף, השימוש התכוף בעכברים מהונדסים גנטי יש חייבת שיטות יעילות של בידוד cardiomyocyte. תרבות טהורה מאפשרת לתנאים חופשיים מאינטראקציה עם איברים אחרים ומחזור המערכתי, כגון באמצעות גורמי neurohormonal ודמוי הורמון אנדוגני 2,3. עם זאת, בידוד מוצלח של שריר לב יכול להיות מאתגר. הפרוטוקול אנחנו מציגים כאן מבוסס על החוויות שלנו עם cardiomyocyt חולדה הבוגרתes ואת השיטה שתוארה על ידי או &#39;קונל ואח&#39; 4,5. במיוחד ב2007 5, הם תיארו טכניקות מפורטות מהכנות חיץ לתרבית תאים וassay הפונקציונלי. מאז myocytes העכבר רגישים מאוד להתכווצות שריר הלב בהשוואה לעכברים, המאגרים או מדיה המשמשים לזלוף, עיכול, Ca 2 + סובלנות, ציפוי והתרבות בפרוטוקול העכבר הם השלימו עם מעכב ספציפי עירור התכווצות צימוד, 2, monoxime 3-Butanedione (BDM) לעכב ההתכווצות הספונטנית שלהם, ומכאן את יכולת הקיום והתשואה של myocytes בצורת המוט לשפר באופן משמעותי. בפרוטוקול הציג כאן, myocytes מופרד בחיץ אשלגן גבוה מהלב המבודד על ידי זלוף Langendorff שונה עם הסוג II collagenase. Collagenase השני שובר בצורה יעילה את המטריצה ​​הבינה תאית ותאים משחרר. פתרון זלוף גם שומר חילוף חומרים תאיים ברמה נמוכה 6. בadditiב, מערכת הלב המבודדת מהרווארד Apparatus אנחנו משמשים כאן היא מעוצבים היטב לטמפרטורה מדויקת ושליטה בלחץ קבועה 7. גישה זו מספקת הכנות לשחזור מאוד ואוכלוסיות אחידות מסוג התא בודד, שניתן להשתמש בם בתרבות הלילה למדידת חלבוני איתות או תרבות 2-3 יום למבחני hypertrophic לב.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

התקדמות טכנולוגית הפכו את העכברים מהונדסים גנטי, בם מהונדס ועכברים בנוקאאוט הגן, כלי חיוני בתחומי מחקר רבים. cardiomyocytes מבוגרים מקובלים מאוד כמודל טוב לפיזיולוגיה הסלולר לב ופתופיזיולוגיה, כמו גם להתערבות תרופתית. עכברים מהונדסים גנטי מונעים את הצורך בתהליכי זיהום cardiomyocyte מסובכים כדי ליצור את הגנוטיפ הרצוי, שאינם יעילים בשל בידול המסוף &#39;שריר הלב. בידוד והתרבות של שריר לב פונקציונלי גבוהה כמות ובאיכות באופן דרמטי ייהנו מחקר לב וכלי דם ולספק כלי חשוב למחקר התמרה תא איתות ופיתוח תרופות. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת היטב לבידוד של שריר לב עכבר בוגר שיכול להיות מיושם עם קצת אימון. לב העכבר הוא נכרת וcannulated למערכת לב מבודדת, אז perfused עם p-סידן חופשי וגבוהotassium חיץ ואחריו סוג II עיכול collagenase במצב זלוף המדרדר Langendorff. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית עבור האוסף של שריר לב עכבר בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

1. כימות בידוד מוצלחת שני קריטריונים משמשים לכמת את ההצלחה של הבידוד: ראשון, המספר הכולל של שריר לב מבודד, ושנית, היחס של myocytes שאינו סובלני בסידן סובלני לעגל בצורת המוט. באופן כללי פרוטוקול זה לוקח בערך 75-90 דקות מהסרת לב לציפוי myocyte ות...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...