Name: isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy
Uploaded: 2014-05-21T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart, Lung, and Blood Institute di Grant HL-36573. Ringraziamo il Sig. David Sowa per la modifica di questo manoscritto.

Tutte le ricerche sui topi è stato fatto secondo le procedure e le linee guida del National Institutes of Health, e i protocolli sono stati approvati dal Comitato delle Università di Toledo Istituzionale cura degli animali ed uso, Collegio di Medicina e Scienze della Vita. 1. Perfusione preparazione sistema <ol><li> Il giorno prima isolamento, riempire l&#39;intero sistema di perfusione (compresi serbatoi) con una soluzione di detersivo veloce senza residui alcalini. Lasciare che la solu...

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	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. 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Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Per la migliore preparazione, i passaggi più critici sono: 1) prontamente agganciando il cuore del mouse alla cannula dopo l&#39;asportazione; 2) perfusione cardiaca appropriata. Si noti inoltre che la qualità dell&#39;acqua, la temperatura perfusione, pH del tampone, la sterilizzazione, la purezza chimica e pulito, tubi e camere non contaminati sono anche fattori importanti. 18.2 mW biologia molecolare-grade H 2 O è altamente raccomandato per la preparazione del buffer. Il pH della soluzione madre ATP 200 mM deve essere regol...

Cardiomiociti non sono proliferativa. Ci sono alcune linee cellulari cardiomiociti atriali, come HL-1 e cellule AT-1 derivate da tumori atriali topo; Tuttavia, non ci sono ventricolari adulto linee cellulari di cardiomiociti disponibili per la ricerca. Colture cellulari primarie di cardiomiociti adulti topo forniscono un modello potente per la ricerca di cuore a livello cellulare e molecolare. Ad oggi, sono stati ampiamente utilizzati per la biochimiche, fisiologiche e farmacologiche di ricerca 1. Inoltre, l&#39;uso frequente di topi geneticamente modificati ha richiesto metodi efficaci di isolamento dei cardiomiociti. Coltura pura permette condizioni di libero dall&#39;interazione con altri organi e circolazione sistemica, ad esempio attraverso fattori endogeni neurormonali e ormoni 2,3. Tuttavia, il successo isolamento di cardiomiociti può essere impegnativo. Il protocollo introduciamo contenute sono basate sulle nostre esperienze con adulti di ratto cardiomyocytes e il metodo descritto da O&#39;Connell et al 4,5. Soprattutto nel 2007 5, hanno descritto le tecniche dettagliate da preparazioni cuscinetto per coltura cellulare e saggio funzionale. Poiché miociti mouse sono molto sensibili alla contrattura rispetto ai cardiomiociti di ratto, i buffer o supporti utilizzati per la perfusione, digestione, Ca 2 + tolleranza, placcatura e cultura nel protocollo del mouse sono integrate con un inibitore di accoppiamento eccitazione-contrazione non specifico, 2, 3-butanedione monoxime (BDM) per inibire la loro contrazione spontanea, e quindi la redditività e la resa dei miociti a forma di bastoncello migliorare in modo significativo. Nel protocollo introdotto qui, i miociti sono separati in un buffer di potassio dal cuore isolato da modificata perfusione Langendorff con collagenasi di tipo II. Collagenase II rompe efficacemente la matrice intercellulare e cellule rilascia. La soluzione perfusione mantiene anche il metabolismo cellulare a un livello basso 6. In additi, il sistema cuore isolato dalla Harvard Apparatus che abbiamo usato qui è ben progettato per un preciso controllo della temperatura e pressione costante 7. Questo approccio fornisce preparazioni altamente riproducibili e popolazioni omogenee di tipo singola cellula, che può essere utilizzato in coltura durante la notte per misurare proteine ​​di segnalazione o coltura 2-3 settimane per saggi ipertrofiche cardiaci.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

I progressi tecnologici hanno reso i topi geneticamente modificati, compresi transgenici e topi knockout gene, uno strumento essenziale in molti campi della ricerca. Cardiomiociti adulti sono ampiamente accettati come un buon modello per la fisiologia cellulare cardiaca e fisiopatologia, così come per intervento farmaceutico. Topi geneticamente modificati escludono la necessità di processi di infezione cardiomiociti complicati per generare il genotipo desiderato, che sono inefficienti a causa differenziazione terminale cardiomiociti. Isolamento e la coltura di grande quantità e qualità cardiomiociti funzionali drammaticamente a beneficio ricerca cardiovascolare e fornire un importante strumento di segnalazione cellulare di ricerca trasduzione e lo sviluppo di farmaci. Qui, descriviamo un metodo consolidato per l&#39;isolamento di cardiomiociti adulti mouse che possono essere implementati con poca formazione. Il cuore del mouse viene asportato e cannulata per un sistema cuore isolato, poi perfusi con un p privo di calcio e altaotassium tampone seguito dal tipo II collagenasi digestione in Langendorff modalità di perfusione retrograda. Questo protocollo produce un risultato coerente per la raccolta dei cardiomiociti funzionali topo adulto da una varietà di topi geneticamente modificati.

1. Quantificazione Isolamento di successo Due sono i criteri utilizzati per quantificare il successo dell&#39;isolamento: in primo luogo, il numero totale di cardiomiociti isolati, e secondo, il rapporto calcio-tolerant per arrotondare miociti non tolleranti a forma di asta. Generalmente questo protocollo richiede intorno 75-90 minuti dalla rimozione di cuore a placcatura miociti e le rese circa 1 milione di cardiomiociti a forma di bastoncello (70-90% dei miociti totali raccolti) da un cuore d...

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Descriviamo un metodo affidabile per l&#39;isolamento di cardiomiociti di topo adulto. Questo protocollo produce un risultato coerente per la cultura di cardiomiociti adulti funzionali da una varietà di topi geneticamente modificati.

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Ricerca

Biologia

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

Isolamento dei Keratinociti Epidermimi del topo e della loro cultura clonogenica in vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...