Name: isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy
Uploaded: 2014-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Vi takker Mr. David Sowa for redigering av dette manuskriptet.

All forskning på mus ble gjort i henhold til prosedyrer og retningslinjer av National Institutes of Health, og protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Toledo, College of Medicine og biovitenskap. En. Perfusjonssystem Forberedelse <ol><li> Dagen før isolasjon, fylle hele perfusjon systemet (inklusive reservoarer) med en oppløsning av fast basisk rest-fritt vaskemiddel. La løsningen suge inn i systemet i noen timer eller over natten. </li>...

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies.">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).</li><li>Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+and+methods.">Cell culture models and methods.</a> Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).</li><li>Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+working+heart.">The working heart.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamic+instability+and+wavelength+in+arrhythmia+maintenance+as+revealed+by+panoramic+imaging+with+blebbistatin+vs.+2,3-butanedione+monoxime.">The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).</li><li>Liu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+Na/K-ATPase+potentiates+Marinobufagenin-induced+cardiac+dysfunction+and+myocyte+apoptosis.">Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

For den beste forberedelsen, de mest kritiske trinnene er: 1) umiddelbart trekke opp muse hjerte til kanylen etter eksisjon; 2) passende hjerte perfusjon. Vær også oppmerksom på at vannkvaliteten, perfusjon temperatur, pH i buffer, sterilisering, kjemisk renhet, og ren, ikke-forurenset tubing og kamre er også viktige faktorer. 18.2 mΩ molekylærbiologi-klasse H 2 O er sterkt anbefalt for buffer forberedelse. PH i 200 mM ATP stamløsning bør justeres til 7,2, et skritt som er lett savnet. Det er viktig raskt i...

Cardiomyocytes er ikke proliferativ. Det er noen atriale cardiomyocyte cellelinjer, som HL-1 og AT-1-celler avledet fra muse atriale tumorer; men det er ingen voksen ventrikkel cardiomyocyte cellelinjer som er tilgjengelige for forskning. Primære cellekulturer fra voksne mus kardiomyocytter gi en kraftig modell for hjerteforskning på cellulært og molekylært nivå. Hittil har de vært brukt mye for biokjemiske, fysiologiske, og farmakologisk forskning en. I tillegg har den hyppige bruken av genmodifiserte mus nødvendig effektive metoder for cardiomyocyte isolasjon. Ren kultur tillater betingelser fri for interaksjon med andre organer og den systemiske sirkulasjon, for eksempel gjennom endogene neurohormonal og hormon-lignende faktorer 2,3. Imidlertid kan vellykket isolering av kardiomyocytter være utfordrende. Protokollen vi introdusere her er basert på våre erfaringer med voksen rotte cardiomyocytes og fremgangsmåten beskrevet av O&#39;Connell et al 4,5. Spesielt i 2007 5, beskrives de detaljerte teknikker fra buffermidler til cellekultur og funksjonelt assay. Siden muse myocytes er svært utsatt for kontraktur i forhold til de rotte cardiomyocytes, blir buffere eller mediene som brukes for perfusjon, fordøyelse, Ca 2 + toleranse, platekledning og kultur i musen protokollen supplert med en uspesifikk eksitasjon-kontraksjon kopling inhibitor, 2, 3-butandion monoxime (BDM) for å hemme deres spontan sammentrekning, derav levedyktighet og utbytte av stavformede myocytes forbedres vesentlig. I protokollen innføres her, er myocytes separeres i en høy kaliumbuffer fra det isolerte hjertet ved modifisert Langendorff perfusjon med type II kollagen-ase. Kollaqenase II bryter effektivt ned inter matrise og frigjør cellene. Perfusjon løsningen holder også cellenes stoffskifte på et lavt nivå seks. I tilpå, er den isolerte hjertet system fra Harvard Apparatus vi brukte her godt designet for nøyaktig temperatur og konstant trykkregulering 7. Denne fremgangsmåten gir svært reproduserbare preparater og ensartede populasjoner av enkeltcelletype, som kan brukes i over natten kultur for å måle signal proteiner eller 2-3 dagers kultur for kardiale hypertrofiske assays.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

Teknologiske fremskritt har gjort genmodifiserte mus, herunder genmodifiserte og genet knockout mus, et viktig verktøy i mange forskningsfelt. Voksen cardiomyocytes er allment akseptert som en god modell for hjerte cellulær fysiologi og patofysiologi, så vel som til farmasøytisk intervensjon. Genetisk modifiserte mus utelukker behovet for kompliserte cardiomyocyte infeksjonsprosesser for å generere den ønskede genotype, som er ineffektive på grunn av kardiomyocytter &#39;terminal differensiering. Isolasjon og kultur av høy kvantitet og kvalitet funksjonelle cardiomyocytes vil dramatisk nytte kardiovaskulær forskning og gi et viktig verktøy for cellesignale transduksjon forskning og legemiddelutvikling. Her beskriver vi en veletablert metode for isolering av voksne mus kardiomyocytter som kan gjennomføres med lite trening. Musen Hjertet ble skåret ut og kanylert til et isolert hjerte-system, og deretter perfusert med et kalsium-fritt og høy potassium buffer etterfulgt av type II collagenase fordøyelsen i Langendorff retrograd perfusjon modus. Denne protokollen gir et konsistent resultat for innsamling av funksjonelle voksen mus cardiomyocytes fra en rekke genmodifiserte mus.

En. Vellykket Isolation Kvantifisering To kriterier er benyttet for å kvantifisere suksessen av isolerings: for det første det totale antall cardiomyocytes isolert, og for det andre forholdet mellom stavformede kalsiumtolerant å runde ikke-tolerante myocytter. Vanligvis denne protokollen tar rundt 75-90 minutter fra hjertet fjerning til myocyte plating og rentene rundt 1 million stavformede Cardiomyocytes (70-90% av totale myocytes høstet) fra en voksen mus hjerte. Dette kan variere med mus...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolasjon og kultur av voksne musen Cardiomyocytes for Cell Signaling og<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiac Hypertrofi

Vi beskriver en pålitelig metode for isolering av voksen mus kardiomyocytter. Denne protokollen gir et konsistent resultat for kulturen i funksjonelle voksne cardiomyocytes fra en rekke genmodifiserte mus.

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Enkelt Cell transcriptional Profilering av Adult Mouse cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolasjon og kultur av individuelle myofibers og deres satellitt celler fra voksne Skeletal Muscle

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon og kultur av Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolasjon, Kultur, og Funksjonell karakterisering av voksne musen Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon og fysiologiske Analyse av Muse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon, kultur og transduksjon av Adult Mouse cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur av primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

Isolering av Mouse epidermal keratinocytter og deres in vitro Clonogenic kultur

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...