Name: isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy
Uploaded: 2014-05-21T14:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Agradecemos ao Sr. David Sowa para a edição deste manuscrito.

Toda a pesquisa em ratos foi feito de acordo com os procedimentos e diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde, e os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use, da Universidade de Toledo, da Faculdade de Medicina e Ciências da Vida. 1. Perfusão de preparação do sistema <ol><li> No dia antes do isolamento, preencher todo o sistema de perfusão (incluindo reservatórios) com uma solução de detergente alcalina livre de resíduos rápido. Permitir que a so...

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. 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F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Para a melhor preparação, as etapas mais críticas são: 1) imediatamente ligar o coração do mouse para a cânula após a excisão; 2) perfusão do coração apropriada. Além disso, observe que a qualidade da água, temperatura de perfusão, pH de tampão, esterilização, pureza química, e limpo, tubos e câmaras não-contaminados também são fatores importantes. 18,2 mohms biologia molecular grau H2O é altamente recomendado para a preparação buffer. O pH da solução de estoque de 200 mM de ATP deve ser ajustado para ...

Os cardiomiócitos não proliferativa. Existem algumas linhas celulares de cardiomiócitos atriais, como HL-1 e AT-1 de células derivadas de tumores de ratinho atrial; no entanto, não há linhas de células de cardiomiócitos ventriculares adulto disponíveis para pesquisa. Culturas de células primárias de cardiomiócitos adultos rato fornecer um modelo poderoso para a pesquisa do coração nos níveis celulares e moleculares. Até à data, têm sido amplamente utilizados para bioquímicos, fisiológicos e farmacológicos de pesquisa 1. Além disso, o uso frequente de camundongos geneticamente modificados exigiu métodos eficazes de isolamento de cardiomiócitos. Cultura pura permite condições livres de interação com outros órgãos e da circulação sistêmica, como através de fatores endógenos neuro-hormonais e hormônios como 2,3. No entanto, isolamento de cardiomiócitos pode ser um desafio. O protocolo apresentamos aqui é baseada em nossas experiências com cardiomyocyt rato adultoes e o método descrito por O&#39;Connell et al 4,5. Especialmente em 2007 5, descreveram técnicas detalhadas de preparações de buffer para cultura de células e ensaio funcional. Desde miócitos rato são altamente suscetíveis a contratura em comparação com os cardiomiócitos de ratos, os tampões ou mídia usada para a perfusão, a digestão, Ca 2 + tolerância, chapeamento e cultura no protocolo do mouse são complementadas com um inibidor de acoplamento excitação-contração inespecífica, 2, 3-butanodiona monoxime (BDM) para inibir a contracção espontânea, por conseguinte, a viabilidade e produtividade de miócitos em forma de bastonete, melhorar significativamente. No protocolo introduzido aqui, os miócitos são separados num tampão de alto teor de potássio do coração isolado por perfusão de Langendorff modificado com colagenase tipo II. Colagenase II rompe de forma eficaz para baixo da matriz intercelular e as células libera. A solução de perfusão também mantém o metabolismo celular a um nível baixo 6. Em comum, além, o sistema de coração isolado de Harvard Apparatus usamos aqui é bem projetado para a temperatura precisa e controle de pressão constante 7. Esta abordagem proporciona preparações altamente reprodutíveis e populações uniformes de tipo de célula única, que pode ser utilizado na cultura de uma noite para a medição de proteínas de sinalização ou de cultura de 2-3 dias para ensaios hipertróficas cardíacas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

Os avanços tecnológicos tornaram ratos geneticamente modificados, incluindo transgênicos e camundongos knockout do gene, uma ferramenta essencial em muitos campos de pesquisa. Cardiomiócitos adultos são amplamente aceito como um bom modelo para a fisiologia celular cardíaca e fisiopatologia, bem como para a intervenção farmacêutica. Camundongos geneticamente modificados exclui a necessidade de processos de infecção de cardiomiócitos complicadas para gerar o genótipo desejado, que são ineficientes devido à diferenciação terminal &#39;cardiomiócitos. Isolamento e cultura de alta quantidade e qualidade cardiomiócitos funcionais irá beneficiar dramaticamente pesquisa cardiovascular e fornecer uma ferramenta importante para a sinalização celular pesquisa transdução e desenvolvimento de medicamentos. Aqui, descrevemos um método bem estabelecido para o isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse que podem ser implementadas com pouco treinamento. O coração do mouse é retirado e canulada a um sistema de coração isolado, então perfundidos com um livre de cálcio e de alto potassium tampão seguido pelo tipo II digestão colagenase em Langendorff modo perfusão retrógrada. Este protocolo produz um resultado consistente para a recolha de cardiomiócitos de rato adulto funcionais a partir de uma variedade de ratinhos geneticamente modificados.

1. Quantificação de isolamento bem sucedido Dois critérios são utilizados para quantificar o sucesso do isolamento: em primeiro lugar, o número total de cardiomiócitos isolados, e em segundo lugar, a proporção de cálcio-tolerante para arredondar miócitos não tolerantes em forma de bastonete. Geralmente este protocolo leva em torno de 75-90 min de remoção coração para chapeamento de miócitos e os rendimentos em torno de 1 milhão de cardiomiócitos em forma de bastonete (70-90% d...

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados.

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Biologia

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...