Name: isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy
Uploaded: 2014-05-21T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de subvención HL-36573. Agradecemos al Sr. David Sowa para la edición de este manuscrito.

Todas las investigaciones con ratones se hizo de acuerdo a los procedimientos y directrices de los Institutos Nacionales de Salud, y los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Toledo, Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida. 1. Perfusión de preparación del sistema <ol><li> El día antes del aislamiento, llenar todo el sistema de perfusión (incluyendo depósitos) con una solución de detergente libre de residuos al...

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. 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Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Para la mejor preparación, los pasos más importantes son: 1) conectar rápidamente hasta el corazón del ratón a la cánula después de la escisión; 2) la perfusión del corazón apropiado. Además, tenga en cuenta que la calidad del agua, la temperatura de perfusión, el pH del tampón, la esterilización, la pureza química y limpia tubos y cámaras, no contaminados son también factores importantes. 18.2 mΩ biología molecular de grado H 2 O es muy recomendable para la preparación de buffer. El pH de la solución madre 2...

Los cardiomiocitos no son proliferativa. Hay algunas líneas celulares de cardiomiocitos auriculares, como HL-1 y las células AT-1 derivadas de tumores de ratón auricular; Sin embargo, no hay ventriculares adultos líneas celulares de cardiomiocitos disponibles para la investigación. Cultivos celulares primarios de cardiomiocitos de ratón adulto proporcionan un poderoso modelo para la investigación del corazón en los niveles celulares y moleculares. Hasta la fecha, se han utilizado ampliamente para la bioquímica, fisiológica, farmacológica y la investigación 1. Además, el uso frecuente de ratones modificados genéticamente ha requerido métodos eficaces de aislamiento de cardiomiocitos. Cultivo puro permite condiciones libres de la interacción con otros órganos y la circulación sistémica, tales como a través de factores neurohormonales y similares a las hormonas endógenas 2,3. Sin embargo, el aislamiento exitoso de los cardiomiocitos puede ser un reto. El protocolo introducimos en este documento se basa en nuestras experiencias con adultos cardiomyocyt rataES y el método descrito por O&#39;Connell et al 4,5. Especialmente en 2007 5, se describen técnicas detalladas a partir de preparaciones de amortiguamiento a cultivo celular y ensayo funcional. Desde los miocitos del ratón son altamente susceptibles a la contractura en comparación con los cardiomiocitos de rata, los tampones o medios utilizados para la perfusión, la digestión, Ca 2 + la tolerancia, la galvanoplastia y la cultura en el protocolo de ratón se complementan con un inhibidor de acoplamiento excitación-contracción no específica, 2, 3-Butanedione monoxima (BDM) para inhibir su contracción espontánea, por lo tanto, la viabilidad y el rendimiento de los miocitos en forma de varilla mejorar significativamente. En el protocolo presentado aquí, los miocitos se separan en un tampón de alto contenido de potasio desde el corazón aislado por perfusión de Langendorff modificada con colagenasa tipo II. La colagenasa II rompe con eficacia por la matriz intercelular y de las células libera. La solución de perfusión también mantiene el metabolismo celular en un nivel bajo 6. En additiencendido, el sistema del corazón aislado de Harvard Apparatus utilizamos aquí está bien diseñado para la temperatura precisa y control de presión constante 7. Este enfoque proporciona preparaciones altamente reproducibles y poblaciones uniformes de solo tipo de células, que se puede utilizar en cultivo durante la noche para la medición de las proteínas de señalización o de cultivo de 2-3 días para los ensayos de hipertróficas cardíacos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

Los avances tecnológicos han hecho que los ratones modificados genéticamente, incluidos los ratones transgénicos y knockout de genes, una herramienta esencial en muchos campos de investigación. Cardiomiocitos adultos son ampliamente aceptados como un buen modelo para la fisiología celular cardiaca y la fisiopatología, así como para la intervención farmacéutica. Ratones genéticamente modificados se oponen a la necesidad de complicados procesos de infección de cardiomiocitos para generar el genotipo deseado, que son ineficientes debido a la diferenciación terminal de los cardiomiocitos. Aislamiento y cultivo de alta cantidad y calidad de los cardiomiocitos funcionales se beneficiarán de manera espectacular la investigación cardiovascular y proporcionar una herramienta importante para la señalización celular investigación transducción y desarrollo de fármacos. Aquí se describe un método bien establecido para el aislamiento de cardiomiocitos adultos de ratón que se pueden implementar con poco entrenamiento. El corazón de ratón se escinde y se canuló a un sistema de corazón aislado, perfundido a continuación, con un p-calcio libre y de altootassium tampón seguido por digestión con colagenasa tipo II en el modo de perfusión retrógrada de Langendorff. Este protocolo produce un resultado coherente para la recogida de los cardiomiocitos de ratón adulto funcionales de una variedad de ratones modificados genéticamente.

1. El éxito de cuantificación Aislamiento Dos criterios se utilizan para cuantificar el éxito del aislamiento: en primer lugar, el número total de cardiomiocitos aislados, y en segundo lugar, la relación de los miocitos no tolerantes al calcio tolerantes a redondear con forma de bastón. Generalmente, este protocolo tiene alrededor de 75 a 90 min de la extirpación del corazón a la chapa de los miocitos y los rendimientos de alrededor de 1 millón de cardiomiocitos en forma de varilla (70...

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Aislamiento y cultivo de ratón adulto cardiomiocitos de Señalización Celular y<em&gt; In vitro</em&gt; Hipertrofia Cardíaca

Se describe un método fiable para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón adulto. Este protocolo se obtiene un resultado coherente para el cultivo de cardiomiocitos adultos funcionales a partir de una variedad de ratones modificados genéticamente.

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Investigación

Biología

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Perfiles de transcripción de los organismos unicelulares de los cardiomiocitos de ratón adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

Aislamiento de los queratinocitos epidérmicos de ratón y su cultivo clonogénico In Vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...