Name: a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics
Uploaded: 2014-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) og Nathaniel Snyder (University of Pennsylvania) for værdifulde diskussioner om masse kalibrering og databehandling. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award nummer R00CA168997. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.

1.. Udarbejdelse af LC-MS reagenser, Etablering af en Chromatography Method, og Etablering af Instrument Operating Procedures <ol><li> Fremstilling af LC Opløsningsmidler <ol><li> Forbered 500 ml mobile faser. A er 20 mM ammoniumacetat og 15 mM ammoniumhydroxid i 3% acetonitril / vand, endelig pH 9,0; og B er 100% acetonitril. </li><li> Løst låg på flasken, som anbringes i et vandbad sonicator, og sonikeres i 10 min uden ekstra opvarmning. (Dette trin er at sikre, at alle ammoniumsaltene opløses fuldstændigt, og...

<ol>
	<li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genomics,+metabolome+analysis,+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks.">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li><li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology.">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li><li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircadiOmics:+Integrating+circadian+genomics,+transcriptomics,+proteomics+and+metabolomics.">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li><li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network.">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC/MS.">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC/MS-based+metabolomic+analyses.">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li><li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+profiling:+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data.">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li><li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+GC/TOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models.">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li><li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids.">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+(GSIS).">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+rate+of+the+glutamate/glutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR.">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li><li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics.">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li><li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma.">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li><li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks.">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li><li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive/negative+ion-switching,+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids,+cells,+and+fresh+and+fixed+tissue.">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li><li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis:+From+SRM+to+HRMS.">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li><li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer.">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+(orbitrap+elite)+facilitates+top+down+LC+MS/MS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes.">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive,+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer.">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li><li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry.">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li><li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis:+Application+to+human+urine.">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

De mest kritiske skridt for en vellykket metabolit profilering i celler ved hjælp af denne protokol er: 1) at styre mediet vækst og omhyggelig udvinding af cellerne; 2) justering af LC metode baseret på MS metode setup til at sikre, at der er nok (normalt mindst 10) datapunkter på tværs af et højdepunkt for kvantificering; 3) gør en lav masse kalibrering før kører prøver; 4) at indsprøjte mere end 5 ml for at undgå retentionstid skiftende og topforbredning forårsaget af vand; og 5) at forberede og kører pr...

Metabolomics, defineret som et eksperiment, der måler flere metabolitter samtidigt, har været et område for intens interesse. Metabolomics giver en direkte udlæsning af molekylær fysiologi og har givet indsigt i udvikling og sygdom som kræft 1-4. Kernemagnetisk resonans (NMR) og gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) er blandt de mest almindeligt anvendte instrumenter 5-9. NMR, især har været anvendt til flux eksperimenter, da tung isotop mærkede forbindelser, såsom 13C mærkede metabolitter, er NMR-aktive 10,11. Men denne strategi kræver relativt høj prøve renhed og stor stikprøve mængde, hvilket begrænser dens anvendelse i metabolomics. I mellemtiden, data indsamlet fra NMR har brug for intensiv analyse og sammensatte tildeling af komplekse NMR-spektre er vanskelig. GC-MS har været meget anvendt til polære metabolitter og lipid undersøgelser, men det kræver flygtig compounDS og derfor ofte derivatisering af metabolitter, som undertiden involverer komplekse kemi, der kan være tidskrævende og introducerer eksperimentel støj. Væskekromatografi (LC) koblet til tripel kvadrupol massespektrometri bruger den første kvadrupol for udvælgelse af de intakte moderioner, som derefter fragmenteret i den anden kvadrupol, mens den tredje kvadrupol bruges til at vælge karakteristiske fragmenter eller datterioner. Denne metode, som registrerer overgangen fra moderioner specifikke datterioner, der betegnes multipel reaktion overvågning (MRM). MRM er en meget følsom, specifik og robust metode til både lille molekyle og protein kvantificering 12-15,21. MRM har dog sine begrænsninger. For at opnå høj specificitet et MRM metode skal bygges for hver metabolit. Denne metode består i at identificere en specifik fragment og tilsvarende optimeret kollision energi, som kræver forudgående kendskab til properties af metabolitter af interesse, såsom kemiske struktur information. Derfor, med nogle undtagelser, der omfatter det neutrale tab af fælles fragmenter, er det ikke muligt at identificere ukendte metabolitter med denne metode. I de senere år har høj opløsning massespektrometri (HRMS) instrumenter blevet frigivet, såsom LTQ-orbitrap og Exactive serie, QuanTof og TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kan give en masse til ladningsforhold (m / z) af intakte ioner inden for en fejl på nogle få ppm. Derfor kan et HRMS instrument betjent ved at detektere alle precursor ioner (dvs. fuld scan mode) få direkte strukturel information fra den nøjagtige masse og den deraf elementært sammensætning af analysanden, og denne information kan bruges til at identificere potentielle metabolitter. Faktisk kan alle oplysninger om en forbindelse opnås med en nøjagtig masse, op til niveauet af strukturelle isomerer. Også en fuldscan metode kræver ikke forudgående kendskab til metabolitter og ikke kræver metode optimering. Da alle ioner med m / z falder i scanning rækkevidde kan analyseres, HRMS har en næsten ubegrænset kapacitet i form af antallet af metabolitter, som kan kvantificeres i et enkelt løb i forhold til MRM metoden. HRMS kan også sammenlignes med en tredobbelt quadrupol MRM i kvantitativ kapacitet på grund af den korte arbejdscyklus resulterer i et sammenligneligt antal datapunkter, der kan opnås i en fuld MS scanning. Derfor HRMS giver en alternativ metode til kvantitative metabolomics. For nylig, en forbedret version af HRMS betegnes Q-Exactive massespektrometri (QE-MS) kan drives under skift mellem positive og negative tilstande med tilstrækkelig hurtig cyklustider i en enkelt metode, som udvider detekteringsområde 19. Her beskriver vi vores metabolomics strategien under anvendelse af QE-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

Metabolite profilering har været et værdifuldt aktiv i studiet af stofskiftet i sundhed og sygdom. Men nuværende platforme har forskellige begrænsende faktorer, såsom arbejdskraftintensive prøve præparater, lave detektionsgrænser, langsomme scan hastigheder, intensiv metode optimering for hver metabolit, og den manglende evne til at måle både positivt og negativt ladede ioner i enkelte eksperimenter. Derfor kunne en roman metabolomics protokol rykke metabolomics studier. Amid-baserede hydrofile kromatografi muliggør polær metabolit analyse uden nogen kemisk derivatisering. Høj opløsning MS ved hjælp af Q-Exactive (QE-MS) har forbedret ion optik, øget scanningshastigheder (256 msek hos opløsning 70.000), og har evnen til at udføre positiv / negativ omskiftning. Ved hjælp af en kold methanolekstraktion strategi og koble et amid søjle med QE-MS giver robust detektion af 168 målrettede polære metabolitter og tusindvis af ekstra funktioner samtidigt. Daten behandlingen foretages med kommercielt tilgængeligt software på en meget effektiv måde, og ukendte features ekstraheret fra massespektrene kan forespørges i databaser.

Nøjagtigheden af ​​metabolomics data meget afhænger af LC-QE-MS instrument performance. For at vurdere, om instrumentet fungerer i god stand, og om den anvendte metode er korrekt, er der flere kendte metabolit LC toppe udvundet fra samlede ionkromatografi (TIC), som vist i fig. 1. Polar metabolitter, herunder aminosyrer, glycolyse mellemprodukter , TCA mellemprodukter, nukleotider, vitaminer, ATP, NADP + og så videre har god opbevaring om søjlen og god Topformerne i amid kolonnen unde...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics at JoVE.com

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profilering har været et værdifuldt aktiv i studiet af stofskiftet i sundhed og sygdom. Ved hjælp af normal-faset væskekromatografi koblet til høj opløsning massespektrometri med polaritet skift og en hurtig arbejdscyklus beskriver vi en protokol til at analysere polære metaboliske sammensætning af biologisk materiale med høj følsomhed, nøjagtighed og opløsning.

En strategi for følsomme, Large Scale Kvantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Assay for Storstilet SNP Genotypebestemmelse Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

ODELAY: En storskala metode til kvantificering af gærvækst i flere parametre

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

En halvautomatisk ChIP-Seq-procedure for store epigenetiske studier

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Storskala forberedelse af synovialvæske mesenkymale stamcelleafledte exosomer ved 3D bioreaktorkultur

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...