Name: a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics
Uploaded: 2014-05-27T13:45:00
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著者らは、質量キャリブレーションおよびデータ処理に関する貴重な議論のためにデトレフシューマン、ジェニファー·サットン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とナサニエル·スナイダー（ペンシルバニア大学）を承認したいと思います。この刊行物で報告された研究が受賞番号R00CA168997の下で国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1。LC-MS試薬、クロマトグラフィ法の確立の準備、計測器操作手順の確立<ol><li> LC溶媒の準備<ol><li> 500ミリリットルの移動相を準備します。 Aは、20mM酢酸アンモニウムおよび3％アセトニトリル/水中の15mMの水酸化アンモニウム、最終pHは9.0であり;そしてBは、100％アセトニトリルである。 </li><li>緩く、ボトルにキャップを水浴超音波処理に置き、そして余分な加熱せずに10分間超音波処理。 （...

<ol>
	<li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genomics,+metabolome+analysis,+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks.">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li><li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology.">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li><li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircadiOmics:+Integrating+circadian+genomics,+transcriptomics,+proteomics+and+metabolomics.">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li><li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network.">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC/MS.">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC/MS-based+metabolomic+analyses.">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li><li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+profiling:+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data.">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li><li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+GC/TOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models.">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li><li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids.">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+(GSIS).">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+rate+of+the+glutamate/glutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR.">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li><li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics.">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li><li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma.">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li><li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks.">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li><li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive/negative+ion-switching,+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids,+cells,+and+fresh+and+fixed+tissue.">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li><li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis:+From+SRM+to+HRMS.">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li><li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer.">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+(orbitrap+elite)+facilitates+top+down+LC+MS/MS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes.">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive,+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer.">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li><li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry.">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li><li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis:+Application+to+human+urine.">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

このプロトコルを使用して、細胞内の正常な代謝物プロファイリングのための最も重要なステップは次のとおりです。1）増殖培地、細胞を慎重に取り出しを制御する。 2）定量のためのピーク間で十分に（通常は少なくとも10）のデータ·ポイントがあることを確認するために、MSメソッドの設定に基づいて、LC法を調整する。 3）サンプルを実行する前に、低質量キャリブレーションを行う。...

同時に複数の代謝物を測定した実験として定義メタボロミクスは、強烈な関心領域となっている。メタボロミクスは、分子生理学の直接的な読み取りを提供し、癌の1-4などの開発や病気への洞察を提供してきました。核磁気共鳴（NMR）、ガスクロマトグラフィー-質量分析（GC-MS）は、最も一般的に使用される器具5-9の一つである。 NMR、特に、13 C標識された代謝産物などの重同位体標識された化合物は、以降フラックス実験のために使用されている、10,11 NMR活性である。しかし、この戦略は、比較的高いサンプル純度とメタボロミクスへの応用が制限され、大きなサンプル量を必要とする。一方、NMRから収集されたデータは、集中的な分析を必要とし、複雑なNMRスペクトルの化合物の割り当てが困難である。 GC-MSは、広く極性代謝および脂質研究のために使用されてきたが、それは揮発性compounを必要とするDS、したがって、場合によっては時間がかかる可能性が錯体化学を伴い、実験ノイズが導入されて代謝物の多くの場合、誘導体化、。 第3の四重極を特徴フラグメントまたは娘イオンを選択するために使用される三連四重極質量分析に連結した液体クロマトグラフィー（LC）は、次いで、第2四重極で断片化された無傷の親イオンを選択するための第1の四重極を使用する。特定の娘イオンの親イオンからの遷移を記録するこの方法は、多重反応モニタリング（MRM）と呼ばれる。 MRMは、小分子とタンパク質定量12-15,21両方のための非常に感度が高く、特異的で、かつロバストな方法である。しかし、MRMはその制限があります。高い特異性を達成するために、MRM方法は、各代謝産物のために構築する必要がある。この方法は、プロペンの事前知識を必要とする、特定のフラグメントを識別し、最適化された衝突エネルギーを対応するから成りこのような化学構造情報のような目的の代謝産物のrties。したがって、一般的なフラグメントのニュートラルロスを伴ういくつかの例外を除いて、それがこの方法で、未知の代謝物を同定することは不可能である。 近年では、高分解能質量分析（HRMS）器具は、例えばLTQ-オービトラップとExactiveシリーズ、QuanTof、およびTripleTOF 5600 16-18,22として、リリースされている。 HRMSは、数ppmの誤差内で無傷のイオンの比（m / z）の質量電荷を提供することができる。したがって、すべての前駆体イオン（ すなわち、フルスキャンモード）を検出することによって操作HRMS器具は、正確な質量及び分析物の得られた元素組成から直接の構造情報を得ることができ、この情報は、潜在的な代謝産物を同定するために用いることができる。実際、化合物に関するすべての情報は、構造異性体のレベルまで、正確な質量を得ることができる。また、フルスキャン方式は、代謝物の予備知識を必要とせず、法の最適化を必要としません。のm / zの走査範囲に落ちると、全てのイオンを分析することができるので、HRMSは、MRM法と比較して、単一の実行で定量することができる代謝産物の数の点でほぼ無制限の容量を有する。 HRMSも発生するフルMSスキャンで得られるデータ点の同程度の数が、その結果、短いデューティ·サイクルに定量的な能力の三連四重極MRMに匹敵する。したがって、HRMSは、定量的メタボロミクスのための代替アプローチを提供します。近年、HRMSの改良版は、（QE-MS）は、検出範囲19を拡張し 、単一の方法では十分に速いサイクル時間を有する正および負のモード間の切り替えの下で動作させることができるQ-Exactive質量分析法と呼ばれる。ここでは、QE-MSを用いて当社のメタボロミクス戦略を説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

代謝物プロファイリングは、健康と病気における代謝の研究に貴重な資産となっている。しかし、現在のプラットフォームでは、このような労働集約的試料調製、低検出限界、スロースキャン速度、各代謝のための集中的な方法の最適化、および積極的に両方を測定することができないことや、単一の実験では負に帯電したイオンなどの異なる制限要因を持っています。このため、新たなメタボロミクスプロトコルはメタボロミクス研究を進めることができます。アミド系親水性クロマトグラフィーは、任意の化学的誘導体化することなく、極性代謝物の分析を可能にします。 Q-Exactive（QE-MS）を用いて高分解能MSは、イオン光学系を改善し、スキャン速度（解像度7万256ミリ秒）に上昇し、正/負切り替えを行う能力を有している。冷メタノール抽出戦略を使用して、QE-MSとのアミドの列を結合することは、同時に、追加機能の168の標的極性代謝と数千のロバストな検出を可能にします。 DAT処理は非常に効率的な方法で市販のソフトウェアを用いて実施され、マススペクトルから抽出された未知の機能がデータベースに照会することができる。

メタボロミクスデータの精度は非常にLC-QE-MS装置の性能に依存します。器具が良好な状態で動作しているかどうかを評価するために、 図1に示すように、適用される方法が適切であるかどうか、いくつかの既知の代謝産物のLCピークは、全イオンクロマトグラム（TIC）から抽出される。アミノ酸を含む極性代謝産物、解糖中間体、TCA中間体、ヌクレオチド、ビタミン、というよう?...

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A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

代謝物プロファイリングは、健康と病気における代謝の研究に貴重な資産となっている。極性切り替えと迅速なデューティサイクルの高分解能質量分析に連結された正常相化液体クロマトグラフィーを利用して、我々は、高感度、精度、および解像度を有する生物学的物質の極性代謝物を分析するためのプロトコルを記載している。

敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略

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