Name: a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics
Uploaded: 2014-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) og Nathaniel Snyder (University of Pennsylvania) for verdifulle diskusjoner om masse kalibrering og databehandling. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Antall R00CA168997. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health.

En. Utarbeidelse av LC-MS-reagenser, Etablering av en Kromatografi Method, og Etablering av Instrument Operating Procedures <ol><li> Utarbeidelse av LC Løse <ol><li> Forbered 500 ml mobilfaser. A er 20 mM ammoniumacetat og 15 mM ammonium-hydroksid i 3% acetonitril / vann, endelig pH 9,0; og B er 100% acetonitril. </li><li> Løst cap flasken, legg den i et vannbad sonicator, og sonicate i 10 min uten ekstra oppvarming. (Dette trinn er å sikre at alle de ammoniumsalter oppløses fullstendig og at det ikke er noen gjen...

<ol>
	<li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genomics,+metabolome+analysis,+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks.">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li><li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology.">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li><li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircadiOmics:+Integrating+circadian+genomics,+transcriptomics,+proteomics+and+metabolomics.">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li><li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network.">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC/MS.">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC/MS-based+metabolomic+analyses.">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li><li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+profiling:+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data.">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li><li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+GC/TOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models.">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li><li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids.">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+(GSIS).">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+rate+of+the+glutamate/glutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR.">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li><li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics.">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li><li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma.">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li><li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks.">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li><li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive/negative+ion-switching,+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids,+cells,+and+fresh+and+fixed+tissue.">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li><li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis:+From+SRM+to+HRMS.">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li><li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer.">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+(orbitrap+elite)+facilitates+top+down+LC+MS/MS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes.">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive,+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer.">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li><li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry.">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li><li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis:+Application+to+human+urine.">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

De mest kritiske trinn for vellykket metabolitt profilering i celler ved hjelp av denne protokoll er: 1) kontroll av vekstmedium og forsiktig ekstraksjon av cellene; 2) justere LC metode basert på MS-metoden oppsett for å sikre at det er nok (vanligvis minst 10) datapunkter over en topp for kvantifisering; 3) gjør en lav masse kalibrering før du kjører prøver; 4) å injisere ikke mer enn 5 ml for å unngå retensjonstid skiftende og maksimal utvidelse forårsaket av vann; og 5) å fremstille og drive ut prøver fo...

Metabolomics, definert som et eksperiment som måler flere metabolitter samtidig, har vært et område med stor interesse. Metabolomics gir en direkte avlesning av molekylær fysiologi og har gitt innsikt i utvikling og sykdom som kreft 1-4. Nukleær magnetisk resonans (NMR) og gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) er blant de mest brukte instrument 5-9. NMR, spesielt har vært brukt i forsøk fluks ettersom tunge isotop merkede forbindelser, for eksempel 13 C-merkede metabolitter, er NMR-aktive 10,11. Men denne strategien krever relativt høy sample renhet og stor prøvemengde, noe som begrenser dets applikasjoner i metabolomics. I mellomtiden, data samlet inn fra NMR trenger intensiv analyse og sammensatte oppdrag av komplekse NMR spektra er vanskelig. GC-MS har vært mye brukt for polare metabolitter og lipid-studier, men det krever volatile sammensetninds og derfor ofte derivatisering av metabolitter, som noen ganger innebærer kompleks kjemi som kan være tidkrevende og introduserer eksperimentell støy. Væskekromatografi (LC) som er koplet til trippel kvadrupol massespektrometer bruker den første kvadrupol for å velge de intakte moder ioner, som deretter fragmentert i den andre kvadrupol, mens den tredje kvadrupol brukes til å velge karakteristiske fragmenter eller datterioner. Denne metoden, som registrerer overgangen fra moder ioner til spesifikke datterioner, er betegnet multiple reaksjons overvåkning (MRM). MRM er en veldig følsom, bestemt, og robust metode for både små molekyl og protein kvantifisering 12-15,21. Men gjør MRM har sine begrensninger. For å oppnå høy spesifisitet en MRM metode må bygges for hver metabolitt. Denne metoden består i å identifisere et bestemt fragment og tilsvarende optimert kollisjonsenergi, noe som krever forhånds kjennskap til properties av metabolitter av interesse, for eksempel kjemisk struktur informasjon. Derfor, med visse unntak som involverer den nøytrale tap av vanlige fragmenter, er det ikke mulig å identifisere ukjente metabolitter med denne metoden. I de senere årene, har høy oppløsning massespektrometri (HRMS) instrumenter blitt utgitt, slik som LTQ-Orbitrap og Exactive serien, QuanTof, og TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kan tilveiebringe en masse for å lade forholdet (m / z) av intakte ioner innenfor en feil på noen få ppm. Derfor kan en HRMS instrument som opereres av lokalisering av forløper-ioner (dvs. fullt scan modus) få direkte strukturell informasjon fra eksakt masse og den resulterende elementsammensetningen av analytten, og denne informasjonen kan benyttes til å identifisere mulige metabolitter. Faktisk, kan all informasjon om en forbindelse oppnås med en nøyaktig masse, opp til nivået av strukturelle isomerer. Dessuten er en helscan-metoden krever ikke kjennskap til metabolitter og krever ikke fremgangsmåten optimalisering. Dessuten, siden alle ioner med m / z faller ned i frekvensområde kan analyseres, har HRMS tilnærmet ubegrenset kapasitet med hensyn til antallet av metabolitter som kan kvantifiseres i et enkelt løp i forhold til MRM-metoden. HRMS er også sammenlignes med en trippel kvadrupol MRM i kvantitativ kapasitet på grunn av den korte driftssyklus resulterer i en tilsvarende antall datapunkter som kan oppnås i en full MS skanne. Derfor HRMS gir en alternativ tilnærming til kvantitative metabolomics. Nylig har en forbedret versjon av HRMS betegnet Q-Exactive massespektrometri (QE-MS) kan betjenes under veksling mellom positive og negative moduser med tilstrekkelig hurtig syklustider i en enkelt fremgangsmåte, som ekspanderer deteksjonsområdet 19.. Her beskriver vi vår metabolomics strategi ved hjelp av QE-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

Metabolitt profilering har vært en verdifull ressurs i studiet av stoffskiftet i helse og sykdom. Men dagens plattformer har ulike begrensende faktorer, som for eksempel arbeidskrevende prøveforberedelser, lave deteksjonsgrenser, treg skannehastigheter, intensiv metode optimalisering for hver metabolitt, og manglende evne til å måle både positivt og negativt ladede ioner i enkelt eksperimenter. Derfor kan en roman metabolomics protokoll avansere metabolomics studier. Amid-baserte hydrofil kromatografi gjør polar metabolitt analyse uten kjemisk derivatisering. Høyoppløsnings MS ved hjelp av Q-Exactive (QE-MS) har forbedret ione-optikk, økt skannehastighet (256 msek ved oppløsning 70000), og har evnen til å utføre positiv / negativ svitsjing. Ved hjelp av en kald metanolekstraksjon strategi, og kobling av et amid kolonne med QE-MS gir robust deteksjon av 168 målrettede polare metabolitter og tusenvis av ekstra funksjoner samtidig. Daten foredling er utført med kommersielt tilgjengelig programvare på en svært effektiv måte, og ukjente egenskaper trukket ut fra massespektra kan spørres i databaser.

Nøyaktigheten av metabolomics data svært avhengig av LC-QE-MS instrument ytelse. For å vurdere om instrumentet fungerer i god stand, og hvorvidt den metode som er benyttet er riktig, er flere kjent metabolitt LC topper ekstrahert fra den totale ione-kromatografi (TIC), som vist i figur 1.. Polare metabolitter, inkludert aminosyrer, glykolysen mellom , TCA mellomprodukter, nukleotider, vitaminer, ATP, NADP + og så videre har god oppbevaring på kolonne og god peak former i amid kolonne und...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics at JoVE.com

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolitt profilering har vært en verdifull ressurs i studiet av stoffskiftet i helse og sykdom. Ved hjelp av normal-faset væskekromatografi koblet til høy-oppløsningsmassespektroskopi med polaritet svitsjing og en hurtig arbeidssyklus beskrives en protokoll for å analysere den polare metabolske Sammensetningen av det biologiske materiale med høy følsomhet, nøyaktighet og oppløsning.

En strategi for Sensitive, Large Scale Kvantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium analyse for Storskala SNP genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

ODELAY: En storskala metode for kvantitativ kvantifisering av gjærvekst

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

En halvautomatisk ChIP-Seq-prosedyre for epigenetiske studier i stor skala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Storskala fremstilling av synovialvæske mesenkymale stamcelleavledede eksosomer ved 3D bioreaktorkultur

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...