Name: a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics
Uploaded: 2014-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить признательность Detlef Шумана, Дженнифер Саттон (Thermo Fisher Scientific) и Натаниэль Снайдер (Университет Пенсильвании) за ценные обсуждения на массового калибровки и обработки данных. Исследования сообщили в настоящей публикации при поддержке Национального института рака из Национального института здоровья в рамках премии Количество R00CA168997. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения.

1. Подготовка LC-MS Реагенты, учреждении метод хроматографии, и создание инструмента оперативных процедур <ol><li> Подготовка LC растворителей <ol><li> Приготовления 500 мл подвижных фаз. 20 мМ ацетата аммония и 15 мМ гидроксида аммония в 3% ацетонитрил / вода, конечный рН 9,0; и B составляет 100% ацетонит...

<ol>
	<li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genomics,+metabolome+analysis,+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks.">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li><li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology.">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li><li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircadiOmics:+Integrating+circadian+genomics,+transcriptomics,+proteomics+and+metabolomics.">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li><li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network.">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC/MS.">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC/MS-based+metabolomic+analyses.">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li><li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+profiling:+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data.">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li><li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+GC/TOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models.">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li><li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids.">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+(GSIS).">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+rate+of+the+glutamate/glutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR.">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li><li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics.">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li><li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma.">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li><li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks.">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li><li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive/negative+ion-switching,+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids,+cells,+and+fresh+and+fixed+tissue.">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li><li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis:+From+SRM+to+HRMS.">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li><li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer.">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+(orbitrap+elite)+facilitates+top+down+LC+MS/MS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes.">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive,+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer.">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li><li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry.">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li><li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis:+Application+to+human+urine.">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

Наиболее важные шаги для успешного профилирования метаболита в клетки, используя этот протокол, являются: 1) контроль за питательную среду и тщательного извлечение клеток; 2) доведение метод LC основана на MS установки метода чтобы у пассажиров было достаточно (обычно не менее 10) точек дан...

Метаболомика, определенные в качестве эксперимента, который измеряет несколько метаболитов одновременно, был в районе интенсивных интерес. Метаболомика обеспечивает прямое считывание молекулярной физиологии и обеспечила понимание развития и заболевания, такие как рак 1-4. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) являются одними из наиболее часто используемых инструментов 5-9. ЯМР, особенно был использован для потока экспериментов с тяжелым изотопом меченых соединений, таких как 13 C меченых метаболитов, являются ЯМР-активных 10,11. Однако, эта стратегия требует относительно высокой чистоты образца и большое количество образцов, что ограничивает ее применение в метаболомики. Между тем, данные, полученные от ЯМР необходим интенсивный анализ и соединение назначение сложных спектров ЯМР трудно. ГХ-МС широко используется для полярных метаболитов и липидов исследований, но она требует летучих compounспуск и поэтому часто дериватизация метаболитов, которая иногда включает сложную химию, что может занять много времени и вводит экспериментальную шум. Жидкостной хроматографии (LC), соединенный с тройной квадрупольный масс-спектрометрии использует первый квадрупольные для выбора неповрежденные родительские ионы, которые затем фрагментированные во втором квадруполе, а третий квадрупольного используется для выбора характерные фрагменты или ионы дочь. Этот метод, который записывает переход от родительских ионов к конкретным дочерних ионов, называется несколько мониторинг реакции (MRM). MRM является очень чувствительным, специфической и надежный метод как для малых молекул и белков количественного 12-15,21. Тем не менее, MRM имеет свои ограничения. Для достижения высокой специфичностью метод МРМ должна быть построена для каждого метаболита. Этот метод состоит в идентификации конкретного фрагмента и соответствующая оптимизированная энергию удара, которая требует предварительной знание Недвижимrties из метаболитов, представляющих интерес, таких, как информация химической структуры. Таким образом, с некоторыми исключениями, связанных с нейтральной потерю общих фрагментов, это не возможно идентифицировать неизвестные метаболиты с этим методом. В последние годы, масс-спектрометрия высокого разрешения (HRMS) инструменты были освобождены, таких как LTQ-Orbitrap и Exactive серии, в QuanTof и TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS может обеспечить массы к заряду (m / z) интактных ионов с точностью в несколько частей на миллион. Поэтому HRMS инструмент работает путем обнаружения все ионы-предшественники (т.е. полный режим сканирования) могут получить прямой структурной информации из точной массы и, как следствие элементного состава анализируемого вещества, и эта информация может быть использована для выявления потенциальных метаболитов. В самом деле, вся информация о соединения могут быть получены с точной массе, до уровня структурных изомеров. Кроме того, полныйметод сканирования не требует предварительных знаний о метаболитов и не требует оптимизации метода. Более того, так как все ионы с м / з попадания в диапазоне сканирования могут быть проанализированы, HRMS имеет почти неограниченные возможности в плане количества метаболитов, которые могут быть количественно за один проход по сравнению с методом MRM. HRMS также сопоставимы с тройной квадруполь MRM в количественном мощности из-за короткого рабочего цикла, что приводит к сопоставимым количество точек данных, которые можно получить в полном MS сканирования. Поэтому HRMS предоставляет альтернативный подход для количественных метаболомики. Недавно улучшенная версия СУЛР называется Q-Exactive масс-спектрометрии (QE-МС) может работать под переключения между положительными и отрицательными мод с раз достаточно быстро циклов из одного метода, который расширяет диапазон обнаружения 19. Здесь мы опишем нашу стратегию метаболомики помощью QE-МС.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

Метаболита профилирования был ценным активом в изучении обмена веществ в норме и патологии. Тем не менее, современные платформы имеют различные лимитирующие факторы, такие как трудоемких образцов препаратов, низких пределов обнаружения, медленных скоростях сканирования, интенсивной оптимизации метода для каждого метаболита, и возможность измерения как положительно, так и отрицательно заряженных ионов в отдельных экспериментах. Таким образом, роман протокол метаболомика могли продвинуться Метаболомика исследования. Амид основе гидрофильные хроматографии позволяет полярный анализ метаболита без какой-либо химической производных. Высокое разрешение MS помощью Q-Exactive (QE-MS) улучшилась ионной оптики, увеличить скорость сканирования (256 мс при разрешении 70000), и имеет возможность проведения положительный / отрицательный переключение. Использование холодного стратегию извлечения метанола, и муфта столбец амидной с QE-МС позволяет надежное обнаружение 168 целевых полярных метаболитов и тысячами дополнительных особенностей одновременно. Датобработка осуществляется с помощью коммерчески доступного программного обеспечения в весьма эффективным способом, и неизвестные характеристики, извлеченные из масс-спектров, может быть получен в базах данных.

Точность данных метаболомики сильно зависит от производительности LC-QE-MS приборов. Чтобы оценить, насколько прибор работает в хорошем состоянии, и является ли метод применяется собственное, несколько известных метаболитов LC пики извлекаются из общей ионной хроматографии (TIC), как показ...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics at JoVE.com

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Метаболита профилирования был ценным активом в изучении обмена веществ в норме и патологии. Используя обычный поэтапное жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения с переключением полярности и быстрым рабочим циклом, мы опишем протокол для анализа полярный метаболический состав биологического материала с высокой чувствительностью, точностью и разрешением.

Стратегия для чувствительной, крупномасштабного Количественные Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Крупномасштабная Экраны метагеномных библиотеки

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Пакетный Иммуноокрашивание крупномасштабных белка Обнаружение в весь мозг обезьяны

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Крупномасштабные данио рерио основе В естественных условиях Малый экран Молекула

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Анализ на крупномасштабных SNP генотипирования приложений

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

ODELAY: крупномасштабный метод многопараметрического количественного определения роста дрожжей

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Полуавтоматизированная процедура ChIP-Seq для крупномасштабных эпигенетических исследований

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Крупномасштабное получение мезенхимальных экзосом, полученных из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости, с помощью 3D-культуры биореактора

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...