Name: sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging at JoVE.com

نشكر الدكتور تيل بوكينغ على بروتوكول إعداد الجزيء الواحد الأصلي. 
تم دعم هذا العمل من قبل NSF منحة 1121972 (SS).

<ol>
	<li>Pang, H. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry.">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4 (2013).</li><li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus.">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+tip&#8211;sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid.">Minimizing tip&#8211;sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue.">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Hernando-P&#233;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Virology:+Direct+Measurement+of+Phage.">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li><li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus.">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Visnapuu, M. -. L., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+surfaces+in+single-molecule+bioscience.">The importance of surfaces in single-molecule bioscience.</a> Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).</li><li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales.">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li><li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Kinetics+of+&#955;+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder.">Single-Molecule Kinetics of &#955; Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li><li>B&#246;cking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating.">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li><li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit.">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li><li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+Spectrin,+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons.">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus.">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li></ol>

ولا توجد مصالح مالية متنافسة للمؤلفين في هذه الورقة.

يمكن استخدام التصوير أحادي الفيروسات باستخدام AFM والتصوير الفلوري عالي الدقة كمنهجية بديلة للتصوير المقطعي CryoEM. ولكل منهجية من هذه المنهجيات نقاط قوتها المحددة. على سبيل المثال يمكن القيام به AFM على virions WT مع عدم وجود شرط على وضع علامات على العينة أو البروتينات الفيروسية الداخلية. موقع الهياكل الفيروسية هو deconvolved من مساهماتها في خصائص مرنة من virion.
واحد virion فائقة الدقة التصوير في تركيبة مع النهج الوراثية الفيروسية العكسية وضعت حديثا يصبح تقنية قوية لتوطين انخفاض عدد نسخة البروتينات الفيروسية20. يمكن إجراء الفيروسات المؤتلفة مع استبدال بروتيناتها مع البروتينات المنصهرة في البروتينات الفلورية وتنقيتها باستخدام هذه النهج الوراثية العكسية. على الرغم من أن التصوير فائق الدقة له خصوصية ويرجع ذلك جزئيا إلى وضع العلامات الجينية ، فإنه يتطلب استخدام الفيروسات المتحولة.
AFM والتصوير فائق الدقة هي أساليب مجانية تستخدم استعدادات عينة مشابهة جدا. الأساليب المبينة في هذه الورقة، والتي اعتمدت شكل في وقت سابق من مقايسات التصوير جزيء واحد، تسمح ترسيخ virions واحد مع آثار قليلة على طوبولوجيا virions.

تستخدم التفاعلات غير المحددة القائمة على الشحن بشكل روتيني لتصاق virions في المجهر للقوة الذرية1،2. هذه التقنيات تعمل بشكل جيد خاصة عند استخدامها على virions غير مجسم مع capsids قاسية جدا3-6. على الرغم من أن هذه التقنيات فعالة جدا في شل العينة، فإنها لا تمنع ربط غير محدد من البروتينات إلى السطح. الربط غير محدد يمكن أن تخلق مشكلة عند محاولة لتصوير virions مع AFM وتقنيات الفلورسينس فائقة الدقة التي تتطلب حضانات العينة مع الأجسام المضادة المختلفة. هنا نوضح طريقة إعداد عينة لشل محددة من virions.
بولي (الإيثيلين غليكول) (PEG) المطعمة إلى بولي (L-lysine) (PLL) ومموج على سطح زجاجي يوفر كتلة كبيرة للتفاعلات الكهروستاتيكية من البروتينات مع الزجاج7. وقد استغلت المقايسات جزيء واحد التي تتطلب شل جزيئات واحدة على الأسطح الزجاجية من هذه الخاصية واستخدامها لإنشاء PEG محددة على أساس تقنية شل جزيء واحد8-10. كما تم استخدام هذا الإعداد لشل أقفاص clathrin على سطح الزجاج11، فضلا عن خلق طلاء فيبروكتين متجانسة للسيطرة على خلية التصاق 12.
لقد اعتمدنا طريقة إعداد العينة على أساس الامتزاز PLL-g-PEG إلى الأسطح الزجاجية من منهجيات تصوير جزيء واحد وتطبيقها على تصوير فيروس واحد من فيروس التهاب الفم الرسغي (VSV). تم تصوير هذه الفيروسات المفردة باستخدام المجهر القوة الذرية (AFM). كما أجريت تجارب مماثلة على الخرز الوظيفي كعنصر تحكم. كما تم تصوير virions بواسطة المجهر الفلوري فائق الدقة كانت الأجسام المضادة VSV-G المسمى مع اليكسا 647 تم استخدامها لخلق صورة للمغلف من virions واحد. يستخدم التصوير الفلوري عالي الدقة توطين جزيئات مفردة لإنشاء صورة13-15. fPALM التصوير ثنائي الخطاف يسمح توطين جزيئات واحدة مع 20 نانومتر في الطائرة و 50 نانومتر القرار على طول المحور البصري15,16. وقد استخدمت هذه التقنية ثنائية الخطاف لتصوير الصور الفلورية فائقة الدقة الموجودة في هذه الدراسة. تقنية بديلة لها نتائج مماثلة هي STORM13,17,18.
كل من AFM وصور الفلورسنت فائقة الدقة من VSV الراسية على الزجاج من خلال الإجراءات المبينة في هذه الورقة، وأظهرت ملزمة محددة من virions إلى الزجاج مع الحد الأدنى من التفاعلات غيرمحددة 19. هنا نقدم بروتوكولات إعداد العينة لAFM وتجارب التصوير الفلوري فائقة الدقة. باختصار: تعمل قطع الأغطية الزجاجية النظيفة عن طريق مبهر خليط من PLL-g-PEG و PLL-g-PEG-biotin. ومن المعتاد لهذا الفيلم رقيقة أن تكون هندسيا لتوفير ما بين 15-25٪ البيوتين وظيفية على سطح مغلفة. يتم احتضان الأغطية بشكل أكبر مع رباعية الميركم أفيدين. ثم يتم استخدام الأجسام المضادة الفيروسية البيوتينية لإنشاء موقع ربط فريد من نوعه للف فحوى. يمكن أن يتم ربط الأجسام المضادة بطريقتين.
الطريقة الأولى هي الأمثل لAFM ومع ذلك فإنه لا يزال مناسبا للتصوير الفلوري فائقة الدقة. في هذه الطريقة يتم التعامل مع سطح أفيدين المغلفة مع الأجسام المضادة البيوتينية قبل التصاق الفيروسي. يتم التعامل مع virions شلت مع اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة لتغطية المغلف والسماح فائقة الدقة التصوير الفلوري من virions.
الطريقة الثانية هي لمهاجمة الفيروس في حل مع الأجسام المضادة البيوتينية واليكسا 647 المسمى الأجسام المضادة قبل التمسك الفيروسات إلى سطح avidin المعالجة. تم تحسين هذه الطريقة لتجارب التصوير الفلوري فائقة الدقة التي يكون فيها استرداد المغلف الفيروسي مهما. هذه الطريقة لديها ميزة السماح طلاء الأجسام المضادة موحدة على السطح الفيروسي. قد يتم خلط الأجسام المضادة البيوتينية مع اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة الفيروسية في النسب التي تسمح لامتزاز كافية من الفيروس إلى السطح المعالج avidin مع الحفاظ على تركيز عال من التسمية الفلورسنت على السطح الخارجي للمغلف الفيروسي. هذه اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة الفيروسية ليست البيوتينية ويمكن شطف الزائدة بعيدا من أجل الحد من الضوضاء الخلفية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

تعطيل virions إلى الأسطح الزجاجية هو خطوة حاسمة في التصوير virion واحد. هنا نقدم تقنية اعتمدت من مقايسات التصوير جزيء واحد الذي يسمح التصاق virions واحد إلى الأسطح الزجاجية مع خصوصية. ويستند هذا الإعداد على تطعيم سطح الزجاج مع خليط من PLL-g-PEG وPLL-g-PEG-Biotin، إضافة طبقة من avidin، وأخيرا خلق المراسي virion من خلال مرفق الأجسام المضادة فيروس البيوتينيلات البيوتينية محددة. لقد طبقنا هذه التقنية عبر مجموعة من التجارب بما في ذلك المجهر القوة الذرية (AFM) والتصوير الفلوري فائق الدقة. ينتج عن طريقة إعداد العينة هذه التصاق تحكم للفيروينات إلى السطح.

التصوير أحادي ال virion باستخدام AFM:
تم استخدام بروتوكول إعداد العينة المبين أعلاه في تثبيت virions نوع البرية إلى السطح الزجاجي. VSV virions هي رصاصة على شكل 180 نانومتر في الطول وقطرها 80 نانومتر. كما أن هناك مجموعة متنوعة من virions التي يمكن تطبيق هذه التقنية، كما يتضح هذا المفهوم هنا على الخرز 36 نانومتر البيوتينية كذلك. تظهر تجارب AFM الناتجة في الشكل 1. من المهم ملاحظة أن VIRIONS VSV لديها معامل يونغ أقل (100 MPa) مقارنة مع الفيروسات غير المفلوثة (GPa). تم الحصول على صور خاصة من VSV virion واحد تحت وضع التنصت في الظروف المحيطة مع cantilever قاسية. وكان الهدف هو تشويه الفيروس لدرجة أن كثافة البروتين الإضافية داخل الفيروس تصبح مرئية كعثرة داخل صورة AFM. وتستخدم هذه الطريقة للكشف عن كثافة البروتين اضافية داخل تجويف الفيروس19.
تصوير أحادي الدقة فائق الدقة:
تم استخدام الأجسام المضادة ALEXA 647 المسمى VSV-G لمعطف مغلف virions VSV الفردية للتجارب فائقة الدقة باستخدام الطريقة 5A. لإظهار كثافة الربط وربط غير محدد منخفضة، يتم عرض مسح كبير للعينة في الشكل 2A. يظهر استرداد المغلف الفيروسي على virion تمثيلي في الشكل 2B (الأزرق isosurface).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 AFM التصوير من الخرز وVSV على سطح PEGG وظيفية. AFM مسح 36 نانومتر الخرز البيوتينية(A, B)وVIRION VSV (C) راسية على السطح مع الأجسام المضادة VSVG البيوتينية. تم إجراء AFM في وضع مسح تضاريس الهواء AC. نصف قطر الطرف هو <25 نانومتر وأجريت القياسات تحت تعديل القوة والتنصت الخفيف. وكان الطرف ثابت قوة 3 N / m والتردد الرنانة 75 كيلوهرتز مع عدم اليقين من 15 كيلوهرتز. في حين احتفظت الخرز بطولها أثناء فحص AFM ، فإن VIRION VSV يحتوي على معامل أصغر بكثير للشباب ومشوه بشكل كبير في الطول. في هذه الصورة تم تصوير virion على وجه التحديد مع cantilever قاسية في وضع التنصت التي أنتجت التواء xy صغيرة (تستخدم لتحديد طرف مقابل نهاية حادة من الفيروس) ويتم استخدام فرق الارتفاع بين طرف ونهاية حادة من الفيروس للكشف عن كثافة البروتين اضافية في نهاية حادة من الفيروس19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم التصوير القائم على الفلورسينس من virions VSV على سطح PEGG وظيفية. أ)virions VSV المؤتلف شلت على سطح PEGG باستخدام الأجسام المضادة VSVG البيوتينية المصورة في مجال واسع مضان. ب)إعادة بناء مضان عالية الدقة من مغلف VSV تعلق على سطح PEGG من خلال جسم مضاد VSVG البيوتينية وزينت مع اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة VSVG (تم استخدام الطريقة 5A لخلق هذه الصور). السطح الأزرق هو إسقاط 2D isosurface. يظهر اليسار نموذجا للفيروس على شكل رصاصة. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">حجم غطاء الغطاء</td>
			<td style="width:93px;">مائع</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 ملم</td>
			<td>65 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 ملم</td>
			<td>50 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 ملم</td>
			<td>36 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 ملم</td>
			<td>25 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 ملم</td>
			<td>16 ميكرولتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1 - الجداول السائل aliquots وفقا لحجم الغطاء.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging at JoVE.com

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

إن ربط الف virions بالسطح هو شرط لتصوير الفيروسة الواحدة عن طريق التصوير الفلوري فائق الدقة أو المجهر للقوة الذرية (AFM). هنا نحن نثبت طريقة إعداد عينة للالتصاق الخاضعة للرقابة من virions إلى الأسطح الزجاجية مناسبة للاستخدام في AFM والتصوير الفلوري فائقة الدقة.

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

الجزئي الميكانيكية توصيف أنسجة الرئة باستخدام القوة الذرية الميكروسكوب

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...