Name: sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging at JoVE.com

We danken Dr. Till Böcking voor het originele single molecule preparation protocol. 
Dit werk werd ondersteund door NSF-subsidie 1121972(SS).

<ol>
	<li>Pang, H. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry.">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4 (2013).</li><li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus.">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+tip&#8211;sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid.">Minimizing tip&#8211;sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue.">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Hernando-P&#233;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Virology:+Direct+Measurement+of+Phage.">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li><li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus.">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Visnapuu, M. -. L., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+surfaces+in+single-molecule+bioscience.">The importance of surfaces in single-molecule bioscience.</a> Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).</li><li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales.">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li><li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Kinetics+of+&#955;+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder.">Single-Molecule Kinetics of &#955; Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li><li>B&#246;cking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating.">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li><li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit.">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li><li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+Spectrin,+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons.">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus.">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li></ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen in dit artikel.

Enkelvoudige virion imaging met AFM en High-resolution fluorescentie imaging kan worden gebruikt als alternatieve methodologie voor CryoEM tomografie. Elk van deze methodologieën heeft zijn specifieke sterke punten. Afm kan bijvoorbeeld worden gedaan op WT virionen zonder dat het monster of de interne virale eiwitten hoeven te worden getagd. De locatie van virale structuren is gedeconvoleerd van hun bijdragen aan de elastische eigenschappen van het virion.
Single virion super-resolution imaging in combinatie met de nieuw ontwikkelde virale reverse genetische benaderingen wordt een krachtige techniek voor het lokaliseren van lage copy number virale eiwitten20. Recombinante virussen met vervanging van hun eiwitten door eiwitten versmolten met fluorescerende eiwitten kunnen worden gemaakt en gezuiverd met behulp van deze omgekeerde genetische benaderingen. Hoewel beeldvorming met superresolutie specificiteit heeft, deels vanwege de genetische tagging, vereist het het gebruik van de mutante virussen.
AFM en superresolutiebeeldvorming zijn complementaire methoden die zeer vergelijkbare monstervoorbereidingen gebruiken. De methoden die in dit artikel worden beschreven, die worden aangenomen, vormen eerdere beeldvormingstesten met één molecuul, maken verankering van enkelvoudige virionen mogelijk met weinig effecten op de topologie van de virionen.

Op lading gebaseerde niet-specifieke interacties worden routinematig gebruikt voor adhesie van virionen in atoomkrachtmicroscopie1,2. Deze technieken werken vooral goed bij gebruik op niet-ontwikkelde virionen met zeer stijve capsids3-6. Hoewel deze technieken zeer effectief zijn in het immobiliseren van het monster, voorkomen ze niet dat niet-specifieke binding van eiwitten aan het oppervlak. De aspecifieke binding kan een probleem veroorzaken bij het in beeld brengen van virionen met AFM en superresolutiefluorescentietechnieken die incubaties van het monster met verschillende antilichamen vereisen. Hier schetsen we een monstervoorbereidingsmethode voor specifieke immobilisatie van virionen.
Poly(ethyleenglycol) (PEG) geënt op poly(L-lysine) (PLL) en geadsorbeerd op een glasoppervlak vormt een belangrijk blok voor de elektrostatische interacties van eiwitten met glas7. Single molecule assays die immobilisatie van enkele moleculen op glazen oppervlakken vereisen, hebben van deze eigenschap geprofiteerd en deze gebruikt om een specifieke PEG-gebaseerde single molecule immobilisatietechniek8-10te creëren. Dit preparaat werd ook gebruikt om clathrinekooien op het glasoppervlak11 te immobiliseren en een homogene fibronectinecoating te creëren voor de hechting van de controlecel 12.
We hebben de monstervoorbereidingsmethode op basis van PLL-g-PEG-adsorptie op glasoppervlakken van beeldvormingsmethoden met één molecuul overgenomen en toegepast op beeldvorming van enkelvoudige virionen van vesiculaire stomatitisvirus (VSV). Deze enkelvoudige virionen werden afgebeeld met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). Soortgelijke experimenten werden ook uitgevoerd op gefunctionaliseerde kralen als een controle. De virionen werden ook afgebeeld door fluorescentiemicroscopie met superresolutie, waarbij een VSV-G-antilichaam met Alexa 647 werd gebruikt om een afbeelding te maken van de envelop van enkele virionen. Fluorescerende beeldvorming met hoge resolutie maakt gebruik van lokalisatie van enkele moleculen om een afbeelding13-15te maken. fPALM bi-planaire beeldvorming maakt lokalisatie van enkele moleculen mogelijk met 20 nm in vlak en 50 nm resolutie langs de optische as15,16. Deze bi-planaire techniek werd gebruikt om fluorescerende beelden met superresolutie in beeld te brengen die in deze studie aanwezig waren. Een alternatieve techniek met vergelijkbare resultaten is STORM13,17,18.
Zowel AFM als superresolutie fluorescerende beelden van VSV die door de in dit document beschreven procedures aan het glas waren verankerd, toonden een specifieke binding van virionen aan het glas met minimale niet-specifieke interacties19. Hier presenteren we de voorbeeldvoorbereidingsprotocollen voor de AFM en superresolutie fluorescentie beeldvormingsexperimenten. In het kort: Schone glasafdekkingen worden gefunctionaliseerd door een mengsel van PLL-g-PEG en PLL-g-PEG-biotine te adsorberen. Het is typisch voor deze dunne film om tussen 15-25% gefunctionaliseerd biotine op een gecoate oppervlakte te verstrekken. De coverslips worden verder geïncubeerd met tetramere avidin. Een biotinylated viraal antilichaam wordt vervolgens gebruikt om een unieke bindingsplaats voor de virionen te creëren. Binding van het antilichaam kan op twee manieren worden gedaan.
De eerste methode is geoptimaliseerd voor AFM, maar blijft geschikt voor superresolutie fluorescentie beeldvorming. Bij deze methode wordt het avidin gecoate oppervlak behandeld met biotinylated antilichaam voorafgaand aan virale adhesie. De geïmmobiliseerde virionen worden behandeld met Alexa 647 gelabeld antilichaam om de envelop te bedekken en fluorescentiebeeldvorming met superresolutie van de virionen mogelijk te maken.
De tweede methode is om het virus in oplossing aan te vallen met het biotinylated antilichaam en Alexa 647 gelabeld antilichaam voordat de virussen aan het met avidin behandelde oppervlak worden vastgehouden; deze methode is geoptimaliseerd voor superresolutie fluorescentiebeeldvormingsexperimenten waarbij herstel van de virale envelop belangrijk is. Deze methode heeft het voordeel dat uniforme antilichaamcoating op het virale oppervlak mogelijk is. Het biotinylated antilichaam kan worden gemengd met Alexa 647 gelabelde virale antilichamen in verhoudingen die voldoende adsorptie van het virus naar het met avidin behandelde oppervlak mogelijk maken met behoud van een hoge concentratie fluorescerend label aan de buitenkant van de virale envelop. Deze Alexa 647 gelabelde virale antilichamen zijn niet biotinylated en hun overmaat kan worden weggespoeld om achtergrondgeluid te verminderen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

Immobilisatie van virionen op glasoppervlakken is een cruciale stap in single virion imaging. Hier presenteren we een techniek die is overgenomen uit beeldvormende assays met één molecuul die hechting van enkelvoudige virionen op glasoppervlakken met specificiteit mogelijk maakt. Dit preparaat is gebaseerd op het enten van het oppervlak van het glas met een mengsel van PLL-g-PEG en PLL-g-PEG-Biotine, het toevoegen van een laag avidine en ten slotte het creëren van virionankers door aanhechting van biotinylated virusspecifieke antilichamen. We hebben deze techniek toegepast in een reeks experimenten, waaronder atoomkrachtmicroscopie (AFM) en fluorescentiebeeldvorming met superresolutie. Deze monstervoorbereidingsmethode resulteert in een controleadhesie van de virionen aan het oppervlak.

Single virion imaging met afm:
Het hierboven beschreven monstervoorbereidingsprotocol werd gebruikt bij het verankeren van virionen van het wilde type aan het glasoppervlak. VSV virionen zijn kogelvormig 180 nm lang en 80 nm in diameter. Omdat er een verscheidenheid aan virionen zijn waarvoor deze techniek kan worden toegepast, wordt het concept hier ook gedemonstreerd op biotinylated 36 nm kralen. De daaruit voortvloeiende AFM-experimenten zijn weergegeven in figuur 1. Het is belangrijk op te merken dat de VSV virionen een lagere Young's modulus (100 MPa) hebben in vergelijking met de niet-ontwikkelde virussen (GPa). De specifieke beelden van single virion VSV werden verkregen onder tapmodus in omgevingsomstandigheden met een stijve cantilever. Het doel was om het virus zo te vervormen dat de extra eiwitdichtheid binnen het virus zichtbaar wordt als een bult binnen het AFM-imago. Deze methode wordt gebruikt om de extra eiwitdichtheid in de virusholte te detecteren19.
Single virion super resolutie beeldvorming:
Alexa 647 gelabelde VSV-G antilichamen werden gebruikt om de envelop van individuele VSV virionen te coaten voor superresolutie experimenten met behulp van methode 5A. Om de tetheringdichtheid en de lage aspecifieke binding aan te tonen, wordt in figuur 2Aeen grote scan van het monster weergegeven . Het herstel van de virale envelop op een representatieve virion is weergegeven in figuur 2B (blauwe isosurface).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Figuur 1. AFM beeldvorming van kralen en VSV op het gefunctionaliseerde PEGG oppervlak. AFM-scan van 36 nm biotinylated beads (A, B) en een VSV virion (C) verankerd aan het oppervlak met een biotinylated VSVG antilichaam. AFM werd gedaan in ac lucht topografie scan modus. De tipradius is <25 nm en metingen werden uitgevoerd onder krachtmodulatie en lichttikken. De tip had een krachtconstante van 3 N/m en resonantiefrequentie 75 kHz met onzekerheid van 15 kHz. Terwijl de kralen hun hoogte behouden tijdens de AFM-scan, heeft de VSV virion een aanzienlijk kleinere jonge modulus en is het aanzienlijk vervormd in hoogte. In deze afbeelding werd de virion specifiek afgebeeld met een stijve cantilever in tapmodus die een kleine xy convolutie produceerde (gebruikt om de tip versus het stompe uiteinde van het virus te bepalen) en het hoogteverschil tussen de punt en het stompe uiteinde van het virus wordt gebruikt om extra eiwitdichtheid aan het stompe uiteinde van het virus te detecteren19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Figuur 2. Fluorescentie gebaseerde beeldvorming van VSV virionen op het PEGG gefunctionaliseerde oppervlak. A) recombinante VSV-virionen geïmmobiliseerd op het PEGG-oppervlak met behulp van een biotinylated anti VSVG-antilichaam afgebeeld in brede veldfluorescentie. B) Fluorescentiereconstructie met hoge resolutie van de envelop van VSV die aan het PEGG-oppervlak is bevestigd door middel van een biotinylated anti VSVG-antilichaam en versierd met Alexa 647 gelabelde anti-VSVG-antilichamen (methode 5A werd gebruikt voor het maken van deze afbeeldingen). Het blauwe oppervlak is een 2D isosurface projectie. Links ziet u een model van het kogelvormige virus. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Coverslip Grootte</td>
			<td style="width:93px;">vloeistof</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Vloeibare aliquots volgens coverslip grootte.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging at JoVE.com

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Micro-mechanische karakterisatie van Lung weefsel met behulp van Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...