Name: sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00
Duration: 5 min 31 s
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Nous remercions le Dr Till Böcking pour le protocole original de préparation d’une molécule unique. 
Ce travail a été soutenu par la subvention NSF 1121972 (SS).

<ol>
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Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents dans le présent document.

L’imagerie à virion unique avec AFM et imagerie par fluorescence à haute résolution peut être utilisée comme méthodologie alternative à la tomographie CryoEM. Chacune de ces méthodologies a ses points forts spécifiques. Par exemple, l’AFM peut être effectuée sur des virions WT sans aucune exigence sur le marquage de l’échantillon ou des protéines virales internes. L’emplacement des structures virales est déconvolvé de leurs contributions aux propriétés élastiques du virion.
L’imagerie à super-résolution à virion unique en combinaison avec les approches génétiques inverses virales nouvellement développées devient une technique puissante pour localiser les protéines virales à faible nombre de copies20. Les virus recombinants avec le remplacement de leurs protéines par des protéines fusionnées à des protéines fluorescentes peuvent être fabriqués et purifiés en utilisant ces approches génétiques inverses. Bien que l’imagerie à super-résolution ait une spécificité en partie due au marquage génétique, elle nécessite l’utilisation des virus mutants.
L’AFM et l’imagerie à super-résolution sont des méthodes complémentaires qui utilisent des préparations d’échantillons très similaires. Les méthodes décrites dans cet article, qui sont adoptées sous forme de tests d’imagerie à molécule unique antérieurs, permettent l’ancrage de virions uniques avec peu d’effets sur la topologie des virions.

Les interactions non spécifiques basées sur la charge sont couramment utilisées pour l’adhésion des virions en microscopie à force atomique1,2. Ces techniques fonctionnent particulièrement bien lorsqu’elles sont utilisées sur des virions non enveloppés avec des capsides très raides3-6. Bien que ces techniques soient très efficaces pour immobiliser l’échantillon, elles n’empêchent pas la liaison non spécifique des protéines à la surface. La liaison non spécifique peut créer un problème lors de la tentative d’image des virions avec des techniques de fluorescence AFM et super-résolution qui nécessitent des incubations de l’échantillon avec divers anticorps. Nous décrivons ici une méthode de préparation d’échantillons pour l’immobilisation spécifique des virions.
Le poly(éthylène glycol) (PEG) greffé à la poly(L-lysine) (PLL) et adsorbé sur une surface vitrée fournit un bloc important pour les interactions électrostatiques des protéines avec le verre7. Les dosages à molécule unique qui nécessitent l’immobilisation de molécules uniques sur des surfaces vitrées ont tiré parti de cette propriété et l’ont utilisée pour créer une technique d’immobilisation de molécule unique spécifique à base de PEG8-10. Cette préparation a également été utilisée pour immobiliser des cages de clathrine sur la surface vitrée11 ainsi que pour créer un revêtement homogène de fibronectine pour contrôler l’adhérence cellulaire 12.
Nous avons adopté la méthode de préparation des échantillons basée sur l’adsorption PLL-g-PEG sur les surfaces vitrées à partir de méthodologies d’imagerie à molécule unique et l’avons appliquée à l’imagerie des virions uniques du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV). Ces virions simples ont été microscopés utilisant la microscopie de force atomique (AFM). Des expériences similaires ont également été réalisées sur des billes fonctionnalisées comme témoin. Les virions ont également été microscopiés par fluorescence à super-résolution où un anticorps VSV-G marqué avec Alexa 647 a été utilisé pour créer une image de l’enveloppe de virions simples. L’imagerie fluorescente haute résolution utilise la localisation de molécules uniques pour créer une image13-15. L’imagerie bi-plane fPALM permet la localisation de molécules uniques avec une résolution de 20 nm dans le plan et de 50 nm le long de l’axe optique15,16. Cette technique bi-plane a été utilisée pour imager des images fluorescentes à super-résolution présentes dans cette étude. Une technique alternative qui a des résultats similaires est STORM13,17,18.
L’AFM et les images fluorescentes à super-résolution de VSV ancrées au verre par les procédures décrites dans ce document, ont montré une liaison spécifique des virions au verre avec un minimum d’interactions non spécifiques19. Nous présentons ici les protocoles de préparation des échantillons pour l’AFM et les expériences d’imagerie fluorescente à super-résolution. En bref: Les lamphes de verre propres sont fonctionnalisées en adsorbant un mélange de PLL-g-PEG et de PLL-g-PEG-biotine. Il est typique que ce film mince soit conçu pour fournir entre 15 et 25% de biotine fonctionnalisée sur une surface enduite. Les lamelle sont en outre incubées avec de l’avidine tétramérique. Un anticorps viral biotinylé est ensuite utilisé pour créer un site de liaison unique pour les virions. La liaison de l’anticorps peut se faire de deux manières.
La première méthode est optimisée pour l’AFM, mais elle reste adaptée à l’imagerie par fluorescence à super-résolution. Dans cette méthode, la surface enduite d’avidine est traitée avec de l’anticorps biotinylé avant l’adhésion virale. Les virions immobilisés sont traités avec un anticorps marqué Alexa 647 pour couvrir l’enveloppe et permettre l’imagerie par fluorescence super-résolution des virions.
La deuxième méthode consiste à attaquer le virus en solution avec l’anticorps biotinylé et l’anticorps marqué Alexa 647 avant d’adhérer les virus à la surface traitée à l’avidine; cette méthode est optimisée pour les expériences d’imagerie par fluorescence à super-résolution dans lesquelles la récupération de l’enveloppe virale est importante. Cette méthode a l’avantage de permettre un revêtement d’anticorps uniforme sur la surface virale. L’anticorps biotinylé peut être mélangé avec des anticorps viraux marqués par Alexa 647 dans des rapports qui permettent une adsorption suffisante du virus sur la surface traitée à l’avidine tout en maintenant une concentration élevée d’étiquette fluorescente à l’extérieur de l’enveloppe virale. Ces anticorps viraux marqués alexa 647 ne sont pas biotinylés et leur excès peut être rincé afin de réduire le bruit de fond.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

L’immobilisation des virions sur les surfaces vitrées est une étape critique dans l’imagerie à virion unique. Nous présentons ici une technique adoptée à partir d’essais d’imagerie à molécule unique qui permet l’adhésion de virions simples à des surfaces vitrées avec spécificité. Cette préparation est basée sur la greffe de la surface du verre avec un mélange de PLL-g-PEG et PLL-g-PEG-Biotine, l’ajout d’une couche d’avidine, et enfin la création d’ancres de virion par fixation d’anticorps spécifiques du virus biotinylé. Nous avons appliqué cette technique à travers une gamme d’expériences, y compris la microscopie à force atomique (AFM) et l’imagerie par fluorescence à super-résolution. Cette méthode de préparation de l’échantillon se traduit par une adhérence de contrôle des virions à la surface.

Imagerie à virion unique à l’aide de l’AFM :
Le protocole de préparation des échantillons décrit ci-dessus a été utilisé pour ancrer des virions de type sauvage à la surface du verre. Les virions VSV sont en forme de balle de 180 nm de longueur et de 80 nm de diamètre. Comme il existe une variété de virions pour lesquels cette technique peut être appliquée, le concept est également démontré ici sur des perles biotinylées de 36 nm. Les expériences AFM qui en résultent sont illustrées à la figure 1. Il est important de noter que les virions vsv ont un module de Young inférieur (100 MPa) comparé aux virus non enveloppés (GPa). Les images particulières de VSV à virion unique ont été obtenues en mode tapotement dans des conditions ambiantes avec un porte-à-faux rigide. L’objectif a été de déformer le virus au point que la densité protéique supplémentaire dans le virus devienne visible sous forme de bosse dans l’image AFM. Cette méthode est utilisée pour détecter la densité protéique supplémentaire dans la cavité virale19.
Imagerie à super résolution virion unique :
Les anticorps VSV-G marqués Alexa 647 ont été utilisés pour recouvrir l’enveloppe de virions VSV individuels pour des expériences de super-résolution utilisant la méthode 5A. Pour démontrer la densité d’attache et la faible liaison non spécifique, un grand balayage de l’échantillon est représenté à la figure 2A. La récupération de l’enveloppe virale sur un virion représentatif est représentée à la figure 2B (isosurface bleue).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Figure 1. Imagerie AFM des billes et du VSV sur la surface pegg fonctionnalisée. AFM scan de billes biotinylées de 36 nm(A, B)et d’un virion VSV(C)ancré à la surface avec un anticorps VSVG biotinylé. L’AFM a été effectué en mode de balayage de la topographie de l’air c.a. Le rayon de pointe est de <25 nm et les mesures ont été effectuées sous modulation de force et taraudage de la lumière. La pointe avait une constante de force de 3 N/m et une fréquence de résonance de 75 kHz avec une incertitude de 15 kHz. Alors que les perles ont conservé leur hauteur pendant le balayage de l’AFM, le virion VSV a un module de young significativement plus petit et est significativement déformé en hauteur. Dans cette image, le virion a été spécifiquement cérumisé avec un porte-à-faux rigide en mode tapotement qui a produit une petite convolution xy (utilisée pour déterminer la pointe vs l’extrémité émoussée du virus) et la différence de hauteur entre la pointe et l’extrémité émoussée du virus est utilisée pour détecter la densité protéique supplémentaire à l’extrémité émoussée du virus19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Figure 2. Imagerie basée sur la fluorescence des virions VSV sur la surface fonctionnalisée PEGG. A)virions VSV recombinants immobilisés sur la surface PEGG à l’aide d’un anticorps anti VSVG biotinylé ionisé en fluorescence à champ large. B)Reconstruction par fluorescence haute résolution de l’enveloppe de VSV fixée à la surface pegg par un anticorps anti-VSVG biotinylé et décoré d’anticorps anti-VSVG marqués Alexa 647 (la méthode 5A a été utilisée pour créer ces images). La surface bleue est une projection isosurface 2D. À gauche montre un modèle du virus en forme de balle. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Taille de la lamelle de couverture</td>
			<td style="width:93px;">fluide</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. Aliquotes fluides selon la taille de la lamelle de couverture.

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Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

La fixation de virions à une surface est une exigence pour l’imagerie à virion unique par imagerie par fluorescence à super-résolution ou microscopie à force atomique (AFM). Nous démontrons ici une méthode de préparation d’échantillons pour une adhérence contrôlée des virions aux surfaces vitrées adaptées à une utilisation dans l’AFM et l’imagerie par fluorescence à super-résolution.

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