Name: sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00
Duration: 5 min 31 s
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Wir danken Dr. Till Böcking für das ursprüngliche Einzelmolekül-Vorbereitungsprotokoll. 
Diese Arbeit wurde durch den NSF-Zuschuss 1121972(SS) unterstützt.

<ol>
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Die Autoren haben in dieser Zeitung keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Als alternative Methode zur CryoEM-Tomographie kann eine Einzelvirion-Bildgebung mit AFM und hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung verwendet werden. Jede dieser Methoden hat ihre spezifischen Stärken. Zum Beispiel kann AFM auf WT Virionen ohne Anforderung auf Diepging der Probe oder der internen viralen Proteine durchgeführt werden. Die Lage viraler Strukturen ist von ihren Beiträgen zu den elastischen Eigenschaften der Virion entkoppelt.
Single Virion Super-Resolution Imaging in Kombination mit den neu entwickelten viralen Reverse genetischen Ansätzen wird eine leistungsfähige Technik zur Lokalisierung der niedrigen Kopierzahl viraler Proteine20. Rekombinante Viren mit Ersatz ihrer Proteine durch Proteine, die zu fluoreszierenden Proteinen verschmolzen sind, können mit diesen umgekehrten genetischen Ansätzen hergestellt und gereinigt werden. Obwohl die Superauflösungsabbildung zum Teil aufgrund der genetischen Kennzeichnung Spezifität hat, erfordert sie die Verwendung der mutierten Viren.
AFM und Super-Resolution Imaging sind kostenlose Methoden, die sehr ähnliche Probenpräparate verwenden. Die in diesem Papier beschriebenen Methoden, die von früheren Einzelmolekül-Bildgebungs-Assays übernommen werden, ermöglichen die Verankerung einzelner Virionen mit geringen Auswirkungen auf die Topologie der Virionen.

Ladungsbasierte unspezifische Wechselwirkungen werden routinemäßig zur Adhäsion von Virionen in der Atomkraftmikroskopie1,2verwendet. Diese Techniken funktionieren besonders gut, wenn sie auf nicht umhüllten Virionen mit sehr steifen Kapsids3-6verwendet werden. Obwohl diese Techniken sehr effektiv bei der Immobilisierung der Probe sind, verhindern sie nicht die unspezifische Bindung von Proteinen an die Oberfläche. Die unspezifische Bindung kann ein Problem verursachen, wenn versucht wird, Virionen mit AFM und super-Resolution-Fluoreszenztechniken abzubilden, die Inkubationen der Probe mit verschiedenen Antikörpern erfordern. Hier skizzieren wir eine Beispielvorbereitungsmethode für die spezifische Immobilisierung von Virions.
Poly(Ethylenglykol) (PEG) mit Poly(L-Lysin) (PLL) veredelt und auf eine Glasoberfläche adsorbiert stellt einen signifikanten Block für die elektrostatischen Wechselwirkungen von Proteinen mit Glas7. Einzelmolekül-Assays, die eine Immobilisierung einzelner Moleküle auf Glasoberflächen erfordern, haben diese Eigenschaft genutzt und sie verwendet, um eine spezifische PEG-basierte Einzelmolekül-Immobilisierungstechnik8-10zu erstellen. Dieses Präparat wurde auch verwendet, um Clathrinkäfige auf die Glasoberfläche11 zu immobilisieren sowie eine homogene Fibronectin-Beschichtung für die Kontrollzellhaftung 12zu schaffen.
Wir haben das Probenvorbereitungsverfahren auf DerGrundlage der PLL-g-PEG-Adsorption auf Glasoberflächen aus bildgebenden Methoden für einzelne Moleküle übernommen und auf bildgebende Einzelvirionen des vesikulären Stomatitisvirus (VSV) angewendet. Diese einzelnen Virionen wurden mit Hilfe der Atomkraftmikroskopie (AFM) abgebildet. Ähnliche Experimente wurden auch an funktionalisierten Perlen als Kontrolle durchgeführt. Die Virionen wurden auch durch superhochauflösende Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, wenn ein VSV-G-Antikörper mit Alexa 647 beschriftet wurde, um ein Bild der Umhüllung einzelner Virionen zu erstellen. Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung nutzt die Lokalisierung einzelner Moleküle, um ein Bild13-15zu erstellen. fPALM bi-planare Bildgebung ermöglicht die Lokalisierung einzelner Moleküle mit 20 nm in der Ebene und 50 nm Auflösung entlang der optischen Achse15,16. Diese biplanare Technik wurde verwendet, um in dieser Studie enthaltene fluoreszierende Bilder mit superauflösung abzubilden. Eine alternative Technik, die ähnliche Ergebnisse hat, ist STORM13,17,18.
Sowohl AFM als auch superhochauflösende fluoreszierende Bilder von VSV, die durch die in diesem Papier beschriebenen Verfahren am Glas verankert sind, zeigten eine spezifische Bindung von Virionen an das Glas mit minimalen unspezifischen Wechselwirkungen19. Hier stellen wir die Probenvorbereitungsprotokolle für die AFM- und super-resolution fluoreszierenden Bildgebungsexperimente vor. Kurz gesagt: Saubere Glasabdeckungen werden funktionalisiert, indem eine Mischung aus PLL-g-PEG und PLL-g-PEG-Biotin adsorbiert wird. Es ist typisch für diesen dünnen Film, der entwickelt werden kann, um zwischen 15-25% funktionalisiertes Biotin auf einer beschichteten Oberfläche zu liefern. Die Coverlips werden weiter mit tetramerischem Avidin inkubiert. Ein biotinylierter viraler Antikörper wird dann verwendet, um eine einzigartige Bindungsstelle für die Virionen zu schaffen. Die Bindung des Antikörpers kann auf zwei Arten erfolgen.
Die erste Methode ist für AFM optimiert, bleibt jedoch für die Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung geeignet. Bei diesem Verfahren wird die avidinbeschichtete Oberfläche vor der viralen Adhäsion mit biotinylierten Antikörpern behandelt. Die immobilisierten Virionen werden mit Alexa 647-beschrifteten Antikörpern behandelt, um die Hülle zu bedecken und eine superhochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung der Virionen zu ermöglichen.
Die zweite Methode besteht darin, das Virus in Lösung mit dem biotinylierten Antikörper und dem von Alexa 647 markierten Antikörper anzugreifen, bevor die Viren an der mit Avidin behandelten Oberfläche haften; Diese Methode ist für superauflösende Fluoreszenz-Bildgebungsexperimente optimiert, bei denen die Wiederherstellung der viralen Hülle wichtig ist. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass eine gleichmäßige Antikörperbeschichtung auf der viralen Oberfläche möglich ist. Der biotinylierte Antikörper kann mit Alexa 647 als virale Antikörper in Verhältnissen vermischt werden, die eine ausreichende Adsorption des Virus auf die mit Avidin behandelte Oberfläche ermöglichen und gleichzeitig eine hohe Konzentration an fluoreszierendem Etikett an der Außenseite der viralen Hülle beibehalten. Diese Alexa 647 markierten viralen Antikörper sind nicht biotinyliert und ihr Überschuss kann wegspült werden, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

Die Immobilisierung von Virionen auf Glasoberflächen ist ein entscheidender Schritt in der Einzelvirionen-Bildgebung. Hier stellen wir eine Technik vor, die aus einzelmolekül-Bildgebungs-Assays übernommen wird, die die Haftung einzelner Virionen auf Glasoberflächen mit Spezifität ermöglicht. Diese Zubereitung basiert auf der Veredelung der Glasoberfläche mit einer Mischung aus PLL-g-PEG und PLL-g-PEG-Biotin, der Zugabe einer Avidinschicht und schließlich der Bildung von Virionankern durch Anhaftung biotinylierter virusspezifischer Antikörper. Wir haben diese Technik in einer Reihe von Experimenten angewendet, einschließlich der Atomkraftmikroskopie (AFM) und der superauflösenden Fluoreszenz-Bildgebung. Diese Probenvorbereitungsmethode führt zu einer Kontrollhaftung der Virionen an der Oberfläche.

Einzelvirionen-Bildgebung mit AFM:
Das oben beschriebene Probenvorbereitungsprotokoll wurde bei der Verankerung von Wildartenvirionen an der Glasoberfläche verwendet. VSV-Virionen sind kugelförmig mit einer Länge von 180 nm und einem Durchmesser von 80 nm. Da es eine Vielzahl von Virions gibt, für die diese Technik angewendet werden kann, wird das Konzept auch hier auf biotinylierten 36 nm Perlen demonstriert. Die resultierenden AFM-Experimente sind in Abbildung 1dargestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass die VSV-Virionen einen niedrigeren Young-Modul (100 MPa) im Vergleich zu den nicht umhüllten Viren (GPa) haben. Die besonderen Bilder von Single Virion VSV wurden im Abstichmodus unter Umgebungsbedingungen mit einem steifen Ausleger erhalten. Das Ziel war es, das Virus so weit zu verformen, dass die zusätzliche Proteindichte innerhalb des Virus als Beule innerhalb des AFM-Bildes sichtbar wird. Diese Methode wird verwendet, um die zusätzliche Proteindichte innerhalb der Virushöhle19zu erkennen.
Einzelvirion Super Auflösung Bildgebung:
Alexa 647 mit VSV-G-Antikörpern beschriftet wurden verwendet, um die Hülle einzelner VSV-Virionen für Super-Auflösungsexperimente mit Methode 5A zu beschichten. Um die Tetheringdichte und die geringe unspezifische Bindung zu veranschaulichen, ist in Abbildung 2Aein großer Scan der Probe dargestellt. Die Wiederherstellung des viralen Umschlags auf einer repräsentativen Virion ist in Abbildung 2B (blaue Isooberfläche) dargestellt.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Abbildung 1. AFM-Bildgebung von Perlen und VSV auf der funktionalisierten PEGG-Oberfläche. AFM-Scan von 36 nm biotinylierten Perlen (A, B) und einem VSV Virion (C), der mit einem biotinylierten VSVG-Antikörper an der Oberfläche verankert ist. AFM wurde im AC-Luft-Topographie-Scan-Modus durchgeführt. Der Spitzenradius beträgt <25 nm und Messungen wurden unter Kraftmodulation und Lichtabstich durchgeführt. Die Spitze hatte eine Kraftkonstante von 3 N/m und Resonanzfrequenz 75 kHz mit einer Unsicherheit von 15 kHz. Während die Perlen während des AFM-Scans ihre Höhe beibehalten haben, hat das VSV Virion einen deutlich kleineren Jungmodul und ist in der Höhe deutlich verformt. In diesem Bild wurde das Virion speziell mit einem steifen Ausleger im Abstichmodus abgebildet, der eine kleine xy-Konvolution erzeugte (zur Bestimmung der Spitze vs. stumpfes Ende des Virus) und der Höhenunterschied zwischen der Spitze und dem stumpfen Ende des Virus wird verwendet, um zusätzliche Proteindichte am stumpfen Ende des Virus19zu erkennen.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Abbildung 2. Fluoreszenzbasierte Abbildung von VSV-Virionen auf der funktionalisierten Oberfläche von PEGG. A) rekombinante VSV-Virionen, die auf der PEGG-Oberfläche mit einem biotinylierten Anti-VSVG-Antikörper in Weitfeldfluoreszenz immobilisiert wurden. B) Hochauflösende Fluoreszenzrekonstruktion der Anhüllung von VSV, die durch einen biotinylierten Anti-VSVG-Antikörper an der PEGG-Oberfläche befestigt ist und mit Alexa 647-beschrifteten Anti-VSVG-Antikörpern verziert ist (Methode 5A wurde zur Erstellung dieser Bilder verwendet). Die blaue Oberfläche ist eine 2D-Isooberflächenprojektion. Links zeigt ein Modell des kugelförmigen Virus. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Coverslip Größe</td>
			<td style="width:93px;">Flüssigkeit</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Fluid aliquots nach Deckslipgröße.

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Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Die Befestigung von Virionen an einer Oberfläche ist eine Voraussetzung für eine einzelne Virionen-Bildgebung durch Super-Resolution Fluoreszenz-Bildgebung oder Atomkraftmikroskopie (AFM). Hier zeigen wir ein Probenvorbereitungsverfahren zur kontrollierten Haftung von Virionen auf Glasoberflächen, die für den Einsatz in AFM und Super-Auflösungfluoreszenz-Bildgebung geeignet sind.

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Research

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Biology

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