Name: sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging at JoVE.com

אנו מודים לד"ר טיל בקינג על פרוטוקול הכנת המולקולה הבודדת המקורי. 
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF 1121972(SS).

<ol>
	<li>Pang, H. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry.">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4 (2013).</li><li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus.">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+tip&#8211;sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid.">Minimizing tip&#8211;sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue.">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Hernando-P&#233;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Virology:+Direct+Measurement+of+Phage.">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li><li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus.">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Visnapuu, M. -. L., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+surfaces+in+single-molecule+bioscience.">The importance of surfaces in single-molecule bioscience.</a> Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).</li><li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales.">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li><li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Kinetics+of+&#955;+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder.">Single-Molecule Kinetics of &#955; Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li><li>B&#246;cking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating.">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li><li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit.">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li><li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+Spectrin,+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons.">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus.">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים במאמר זה.

הדמיית ויריון יחיד עם AFM והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה יכולה לשמש כמתודולוגיה חלופית לטומוגרפיה של CryoEM. לכל אחת מהמתודולוגיות האלה יש את החוזקות הספציפיות שלהן. לדוגמה AFM יכול להיעשות על virions WT ללא דרישה על תיוג המדגם או חלבונים ויראליים פנימיים. המיקום של מבנים ויראליים הוא deconvolved מתרומתם לתכונות אלסטיות של virion.
הדמיה ברזולוציה-על של virion יחיד בשילוב עם הגישות הגנטיות ההפוכות הנגיפיות שפותחו לאחרונה הופכת לטכניקה רבת עוצמה ל לוקליזציה של מספר עותק נמוך של חלבונים ויראליים20. וירוסים רקומביננטיים עם החלפת החלבונים שלהם בחלבונים מותכים לחלבונים פלואורסצנטיים יכולים להיעשות ומטוהרים באמצעות גישות גנטיות הפוכות אלה. למרות שלהדמיה ברזולוציית-על יש ספציפיות בין השאר בשל התיוג הגנטי, היא דורשת שימוש בווירוסים המוטנטיים.
AFM והדמיה ברזולוציית-על הן שיטות משלימות המשתמשות בהכנות מדגמיות דומות מאוד. השיטות המתוארות במאמר זה, אשר מאומצות טופס מוקדם יותר מולקולה אחת הדמיה מבחנים, לאפשר עיגון של virions יחיד עם השפעות מועטות על הטופולוגיה של virions.

אינטראקציות לא ספציפיות המבוססות על טעינה משמשות באופן שגרתי להדבקה של ויראליות במיקרוסקופיה של כוח אטומי1,2. טכניקות אלה במיוחד לעבוד היטב כאשר נעשה שימוש על virions nonenveloped עם capsids נוקשה מאוד3-6. למרות טכניקות אלה יעילים מאוד בשיתוק המדגם, הם אינם מונעים כריכה לא ספציפית של חלבונים על פני השטח. הכריכה הלא ספציפית יכולה ליצור בעיה בעת ניסיון לדמיין virions עם AFM וטכניקות פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר הדורשים דגירה של המדגם עם נוגדנים שונים. כאן אנו מתארים שיטת הכנה לדוגמה לשיתוק ספציפי של virions.
פולי(אתילן גליקול) (PEG) מושתל פולי (L-ליצין) (PLL) וספג על משטח זכוכית מספק בלוק משמעותי עבור אינטראקציות אלקטרוסטטיות של חלבונים עםזכוכית 7. בדיקות מולקולה אחת הדורשות קיבוע של מולקולות בודדות על משטחי זכוכית ניצלו תכונה זו והשתמשו בה כדי ליצור טכניקת קיבוע מולקולה אחת מבוססת PEG ספציפית8-10. הכנה זו שימשה גם כדי לשתק כלובי clathrin על משטח הזכוכית11, כמו גם יצירת ציפוי פיברונצ'ין הומוגני עבור הידבקות תא בקרה 12.
אימצנו את שיטת ההכנה לדוגמה המבוססת על ספיחה PLL-g-PEG למשטחי זכוכית ממתודולוגיות הדמיה של מולקולה אחת ויישמנו אותה להדמיית וירונים בודדים של וירוס stomatitis שלפוחית השתן (VSV). נגיףים יחידים אלה צולמו באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM). ניסויים דומים בוצעו גם על חרוזים פונקציונליים כפקד. virions צולמו גם על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר היו נוגדן VSV-G שכותרתו עם Alexa 647 שימש ליצירת תמונה של המעטפה של virions יחיד. הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה משתמשת בלוקליזציה של מולקולות בודדות כדי ליצור תמונה13-15. הדמיה דו-מישורית של fPALM מאפשרת לוקליזציה של מולקולות בודדות עם 20 ננומטר במישור ורזולוציה של 50 ננומטר לאורך הציר האופטי15,16. טכניקה דו-מישורית זו שימשה לתמונות פלואורסצנטיות ברזולוציית-על הקיימות במחקר זה. טכניקה חלופית אשר יש תוצאות דומות היא STORM13,17,18.
הן AFM והן תמונות פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר של VSV מעוגנות לזכוכית על ידי ההליכים המתוארים במאמר זה, הראו כריכה ספציפית של virions לזכוכית עם אינטראקציות מינימליות לא ספציפיות19. כאן אנו מציגים את פרוטוקולי ההכנה לדוגמה עבור AFM וניסויי הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר. בקצרה: כיסויי זכוכית נקייה מתפקדים על ידי ספיחה של תערובת של PLL-g-PEG ו- PLL-g-PEG-ביוטין. זה אופייני עבור סרט דק זה להיות מהונדס לספק בין 15-25% ביוטין פונקציונלי על משטח מצופה. הכיסויים הם דגירה נוספת עם אבידין טטרמרי. נוגדן ויראלי biotinylated משמש לאחר מכן כדי ליצור אתר מחייב ייחודי עבור virions. כריכת הנוגדן יכולה להיעשות בשתי דרכים.
השיטה הראשונה ממוטבת עבור AFM אולם היא נשארת מתאימה להדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציית-על. בשיטה זו המשטח מצופה אבידין מטופל בנוגדן biotinylated לפני הידבקות ויראלית. virions משותק מטופלים עם אלקסה 647 שכותרתו נוגדן כדי לכסות את המעטפה ולאפשר הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר של virions.
השיטה השנייה היא לתקוף את הנגיף בתמיסה עם הנוגדן biotinylated ו Alexa 647 שכותרתו נוגדן לפני הדבקת הנגיפים על פני השטח שטופלו אבידין; שיטה זו ממוטבת לניסויי הדמיה פלואורסצנטיים ברזולוציית-על שבהם ההתאוששות של המעטפה הנגיפית חשובה. לשיטה זו יש יתרון במתן ציפוי נוגדנים אחיד על פני השטח הנגיפיים. הנוגדן biotinylated עשוי להיות מעורבב עם Alexa 647 שכותרתו נוגדנים ויראליים ביחסים המאפשרים ספיחה מספקת של הנגיף על פני השטח שטופלו אבידין תוך שמירה על ריכוז גבוה של תווית פלואורסצנטית בצד החיצוני של המעטפה הנגיפית. נוגדנים ויראליים אלה של Alexa 647 אינם ביו-טיניליים וניתן לשטוף את העודף שלהם כדי להפחית את רעשי הרקע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

קיבוע של virions למשטחי זכוכית הוא צעד קריטי בהדמיית virion יחיד. כאן אנו מציגים טכניקה שאומצה ממבחני הדמיה של מולקולה אחת המאפשרת הידבקות של ויראליות בודדות למשטחי זכוכית עם ספציפיות. הכנה זו מבוססת על השתלת פני השטח של הזכוכית עם תערובת של PLL-g-PEG ו- PLL-g-PEG-Biotin, הוספת שכבה של avidin, ולבסוף יצירת עוגני virion באמצעות התקשרות של נוגדנים ספציפיים וירוס biotinylated. יישמנו טכניקה זו במגוון ניסויים, כולל מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה. שיטת הכנת מדגם זו גורמת הידבקות שליטה של virions על פני השטח.

הדמיית ויריון יחיד באמצעות AFM:
פרוטוקול ההכנה לדוגמה שתואר לעיל שימש לעיגון וירונים מסוג בר למשטח הזכוכית. ויראלי VSV הם בצורת כדור 180 ננומטר אורך ו 80 ננומטר קוטר. כפי שיש מגוון של virions אשר טכניקה זו עשויה להיות מיושמת, הרעיון מודגם גם כאן על חרוזי biotinylated 36 ננומטר גם כן. ניסויי AFM המתקבלים מוצגים באיור 1. חשוב לציין כי virions VSV יש מודולוס של יאנג נמוך יותר (100 MPa) לעומת וירוסים nonenveloped (GPa). התמונות הספציפיות של VSV virion יחיד התקבלו במצב הקשה בתנאי הסביבה עם cantilever נוקשה. המטרה הייתה לעוות את הנגיף עד כדי כך שצפיפות החלבון הנוספת בתוך הנגיף הופכת גלויה כמו בליטה בתוך תמונת AFM. שיטה זו משמשת לגילוי צפיפות החלבון הנוספת בתוך חלל הנגיף19.
הדמיה ברזולוציית-על של virion יחיד:
אלקסה 647 שכותרתו נוגדני VSV-G שימשו כדי לצפות את המעטפה של virions VSV בודדים עבור ניסויים ברזולוציה סופר באמצעות שיטה 5A. כדי להדגים את צפיפות הרצועה ואת הכריכה הלא ספציפית הנמוכה, סריקה גדולה של המדגם מוצגת באיור 2A. ההתאוששות של המעטפה הנגיפית על ויריון מייצג מוצגת באיור 2B (פני isosurface כחולים).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
איור 1. הדמיית AFM של חרוזים ו VSV על פני השטח PEGG פונקציונלי. סריקת AFM של 36 ננומטר חרוזים ביוטינילציה (A, B) ו- VSV virion (C) מעוגן על פני השטח עם נוגדן VSVG biotinylated. AFM נעשה במצב סריקה של טופוגרפיית אוויר AC. רדיוס הקצה הוא <25 ננומטר ומדידות בוצעו תחת אפנון כוח והקשה קלה. הקצה היה קבוע כוח של 3 N / m ותדר מהדהד 75 kHz עם אי ודאות של 15 kHz. בעוד החרוזים שמרו על גובהם במהלך סריקת AFM, ויריון VSV יש מודולוס של צעיר קטן משמעותית והוא מעוות באופן משמעותי בגובה. בתמונה זו virion היה בתמונה במיוחד עם cantilever נוקשה במצב הקשה אשר הפיק קונבולוציה xy קטן (משמש כדי לקבוע את קצה לעומת קצה קהה של הנגיף) ואת הפרש הגובה בין קצה קצה בוטה של הנגיף משמש כדי לזהות צפיפות חלבון נוספת בקצה הקהה של הנגיף19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> איור 2. הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות של ויראליות VSV על פני השטח התפקודיים של PEGG. A) ויראלי VSV רקומביננטי משותק על פני השטח PEGG באמצעות נוגדן אנטי VSVG biotinylated בתמונה פלואורסצנטיות שדה רחב. B) שחזור פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה של מעטפת VSV המחוברת למשטח ה- PEGG באמצעות נוגדן אנטי VSVG ביוטינילציה ומעוצבת בנוגדנים של Alexa 647 הנקראים נוגדנים נגד VSVG (שיטה 5A שימשה ליצירת תמונות אלה). המשטח הכחול הוא הקרנת isosurface דו-ממדית. משמאל מוצג דגם של הווירוס בצורת תבליט. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">גודל כיסוי</td>
			<td style="width:93px;">נוזל</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 מ"מ</td>
			<td>65 מיקרול</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 מ"מ</td>
			<td>50 מיקרול</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 מ"מ</td>
			<td>36 מיקרול</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 מ"מ</td>
			<td>25 מיקרול</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 מ"מ</td>
			<td>16 מיקרול</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1. אלציטוטים נוזליים לפי גודל ה-coverslip.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging at JoVE.com

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

ההחזקה של virions על פני השטח היא דרישה להדמיית virion יחיד על ידי הדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר או מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM). כאן אנו מדגימים שיטת הכנה לדוגמה להדבקה מבוקרת של virions למשטחי זכוכית המתאימים לשימוש AFM והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר.

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...