Name: sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00
Duration: 5 min 31 s
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हम मूल एकल अणु तैयारी प्रोटोकॉल के लिए डॉ जब तक Böcking शुक्रिया अदा करते हैं । 
इस कार्य को एनएसएफ ग्रांट ने दिया समर्थन 1121972

<ol>
	<li>Pang, H. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry.">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4 (2013).</li><li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus.">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+tip&#8211;sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid.">Minimizing tip&#8211;sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue.">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Hernando-P&#233;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Virology:+Direct+Measurement+of+Phage.">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li><li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus.">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Visnapuu, M. -. L., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+surfaces+in+single-molecule+bioscience.">The importance of surfaces in single-molecule bioscience.</a> Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).</li><li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales.">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li><li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Kinetics+of+&#955;+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder.">Single-Molecule Kinetics of &#955; Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li><li>B&#246;cking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating.">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li><li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit.">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li><li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+Spectrin,+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons.">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus.">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li></ol>

लेखकों को इस कागज में कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

एएफएम और हाई-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ सिंगल विरियमेंट इमेजिंग का उपयोग क्रायोम टोमोग्राफी के लिए वैकल्पिक पद्धति के रूप में किया जा सकता है। इन पद्धतियों में से हर एक की अपनी विशिष्ट शक्तियां हैं । उदाहरण के लिए एएफएम को WT विरियंस पर किया जा सकता है जिसमें नमूने या आंतरिक वायरल प्रोटीन को टैग करने की कोई आवश्यकता नहीं है। वायरल संरचनाओं का स्थान वीरन के लोचदार गुणों में उनके योगदान से विघटित है।
नव विकसित वायरल रिवर्स जेनेटिक दृष्टिकोणों के संयोजन में एकल विरेशन सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग कम कॉपी नंबर वायरल प्रोटीन20को स्थानीय बनाने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बन जाती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े प्रोटीन के साथ अपने प्रोटीन के प्रतिस्थापन के साथ recombinant वायरस बनाया जा सकता है और इन रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग कर शुद्ध । हालांकि सुपर संकल्प इमेजिंग आनुवंशिक टैगिंग के कारण भाग में विशिष्टता है, यह उत्परिवर्ती वायरस के उपयोग की आवश्यकता है ।
एएफएम और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग मानार्थ तरीके हैं जो बहुत ही समान नमूना तैयारी का उपयोग करते हैं। इस पत्र में उल्लिखित तरीके, जो पहले एकल अणु इमेजिंग परखते हुए अपनाए जाते हैं, वीरों के टोपोलॉजी पर थोड़ा प्रभाव के साथ एकल विरनों को एंकरिंग की अनुमति देते हैं।

आवेश आधारित गैर - विशिष्ट बातचीत नियमित रूप से परमाणु बल माइक्रोस्कोपी1,2में विषाणुओं के आसंजन के लिए उपयोग की जाती है। ये तकनीकें विशेष रूप से अच्छी तरह से काम करती हैं जब बहुत कठोर कैप्सिड3-6के साथ नॉनएनवेलोप्ड विरियंस पर उपयोग किया जाता है। यद्यपि ये तकनीकें नमूने को स्थिर करने में बहुत प्रभावी हैं, लेकिन वे सतह पर प्रोटीन के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को नहीं रोकते हैं। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी एएफएम और सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस तकनीकों के साथ विरशन छवि का प्रयास करते समय एक समस्या पैदा कर सकता है जिसके लिए विभिन्न एंटीबॉडी के साथ नमूने के ऊष्मायनों की आवश्यकता होती है। यहां हम वीरन्धों के विशिष्ट स्थिरीकरण के लिए एक नमूना तैयारी विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं।
पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) पॉली (एल-लिसाइन) (पीएलएल) और कांच की सतह पर सोखने के लिए ग्राफ्ट ग्लास7के साथ प्रोटीन के इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के लिए एक महत्वपूर्ण ब्लॉक प्रदान करता है। एकल अणु परख जो कांच की सतहों पर एकल अणुओं के स्थिरीकरण की आवश्यकता है इस संपत्ति का लाभ ले लिया है और यह एक विशिष्ट खूंटी आधारित एकल अणु स्थिरीकरण तकनीक8-10बनाने के लिए इस्तेमाल किया । इस तैयारी का उपयोग कांच की सतह11 पर क्लैथ्रिन पिंजरों को स्थिर करने के साथ - साथ नियंत्रण कोशिका आसंजन 12के लिए समरूप फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग बनाने के लिए भी किया गया था ।
हमने एकल अणु इमेजिंग पद्धतियों से कांच की सतहों के लिए पीएलएल-जी-खूंटी सोखने के आधार पर नमूना तैयारी विधि अपनाई है और इसे वेसिकुलर स्टोमेटाइटिस वायरस (वीएसवी) के एकल विषाणुओं पर लागू किया है। इन एकल विषाणुओं को परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का उपयोग करके चित्रित किया गया था। इसी तरह के प्रयोग भी एक नियंत्रण के रूप में कार्यात्मक मोतियों पर किए गए थे। उग्रता को सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा भी इमेज किया गया था, जो एलेक्सा 647 के साथ लेबल किए गए वीएसवी-जी एंटीबॉडी थे, जिनका उपयोग एकल विरनों के लिफाफे की छवि बनाने के लिए किया गया था। उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट इमेजिंग13-15छवि बनाने के लिए एकल अणुओं के स्थानीयकरण का उपयोग करता है। fPALM द्वि-planar इमेजिंग विमान में 20 एनएम और ऑप्टिकल एक्सिस15,16 साथ 50एनएम संकल्प के साथ एकल अणुओं के स्थानीयकरण की अनुमति देता है . इस द्वि-प्लानर तकनीक का उपयोग इस अध्ययन में मौजूद सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरोसेंट छवियों को छवि देने के लिए किया गया था। एक वैकल्पिक तकनीक जिसके समान परिणाम होते हैं, वह हैस्टॉर्म 13,17,18.
इस पेपर में उल्लिखित प्रक्रियाओं द्वारा ग्लास में लंगर डाले गए वीएसवी की एएफएम और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरोसेंट छवियों दोनों ने न्यूनतम गैर-विशिष्ट बातचीत19के साथ ग्लास में वीरन्य के विशिष्ट बाध्यकारी दिखाए। यहां हम एएफएम और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रयोगों के लिए नमूना तैयारी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। संक्षेप में: साफ ग्लास कवर्लिप को पीएलएल-जी-खूंटी और पीएलएल-जी-खूंटी-बायोटिन के मिश्रण को सोखकर कार्यात्मक किया जाता है। इस पतली फिल्म को लेपित सतह पर 15-25% कार्यात्मक बायोटिन के बीच प्रदान करने के लिए इंजीनियर किया जाना विशिष्ट है। कवरस्लिप को टेट्रामेरिक एविडिन के साथ आगे बढ़ाया जाता है। इसके बाद एक बायोटिनाइलेटेड वायरल एंटीबॉडी का उपयोग विरशन के लिए एक अद्वितीय बाध्यकारी साइट बनाने के लिए किया जाता है। एंटीबॉडी का बाइंडिंग दो तरह से किया जा सकता है।
पहली विधि AFM के लिए अनुकूलित है, लेकिन यह सुपर संकल्प फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए उपयुक्त रहता है । इस विधि में एविडिन लेपित सतह वायरल आसंजन से पहले बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी के साथ इलाज किया जाता है। स्थिर उग्रता को लिफाफे को कवर करने और स्पीरियंस के सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग की अनुमति देने के लिए एलेक्सा 647 लेबल एंटीबॉडी के साथ इलाज किया जाता है।
दूसरी विधि एविडिन उपचारित सतह पर वायरस का पालन करने से पहले बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी और एलेक्सा 647 लेबल एंटीबॉडी के साथ समाधान में वायरस पर हमला करना है; इस विधि को सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया गया है जिसमें वायरल लिफाफे की वसूली महत्वपूर्ण है। इस विधि में वायरल सतह पर एक समान एंटीबॉडी कोटिंग की अनुमति देने का लाभ है। बायोटिनेलेटेड एंटीबॉडी को एलेक्सा 647 लेबल वाले वायरल एंटीबॉडी के साथ अनुपात में मिलाया जा सकता है जो वायरल लिफाफे के बाहरी हिस्से पर फ्लोरोसेंट लेबल की उच्च एकाग्रता बनाए रखते हुए एविडिन उपचारित सतह पर वायरस के पर्याप्त अवशोषण की अनुमति देता है। ये एलेक्सा 647 लेबल वायरल एंटीबॉडी बायोटिनाइलेटेड नहीं हैं और पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए उनकी अतिरिक्त को धोया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

कांच की सतहों के लिए विषुव का स्थिरीकरण एकल वीर्य इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण कदम है। यहां हम एकल अणु इमेजिंग परख से अपनाई गई एक तकनीक प्रस्तुत करते हैं जो विशिष्टता के साथ कांच की सतहों के लिए एकल विरनों के आसंजन की अनुमति देता है। यह तैयारी पीएलएल-जी-खूंटी और पीएलएल-जी-खूंटी-बायोटिन के मिश्रण के साथ ग्लास की सतह को ग्राफ्टिंग करने पर आधारित है, जो एविडिन की एक परत जोड़ती है, और अंत में बायोटिनाइलेटेड वायरस विशिष्ट एंटीबॉडी के लगाव के माध्यम से विरीन एंकर बनाती है। हमने इस तकनीक को परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग सहित कई प्रयोगों में लागू किया है। इस नमूना तैयारी विधि के परिणामस्वरूप सतह पर विरनों का नियंत्रण आसंजन होता है।

एएफएम का उपयोग करके एकल उग्र इमेजिंग:
ऊपर उल्लिखित नमूना तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग कांच की सतह पर जंगली प्रकार के विरियन को एंकरिंग में किया गया था। वीएसवी विरन्स लंबाई में 180 एनएम और व्यास में 80 एनएम की लंबाई में गोली के आकार के होते हैं। चूंकि विभिन्न प्रकार के विरान हैं जिनके लिए इस तकनीक को लागू किया जा सकता है, इस अवधारणा को यहां बायोटिनाइलेटेड 36 एनएम मोतियों पर भी प्रदर्शित किया जाता है। परिणामस्वरूप एएफएम प्रयोग चित्र 1में दिखाए गए हैं । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वीएसवी विरियंस में नॉनएनवेलोप्ड वायरस (जीपीए) की तुलना में कम युवा मोडुलस (100 एमपीए) है। एक कड़ी कैंटिलीवर के साथ परिवेश की स्थितियों में टैपिंग मोड के तहत एकल विरेशन वीएसवी की विशेष छवियां प्राप्त की गई थीं। इसका उद्देश्य वायरस को इस बात के लिए विकृत करना रहा है कि वायरस के भीतर अतिरिक्त प्रोटीन घनत्व एएफएम छवि के भीतर टक्कर के रूप में दिखाई देता है। इस विधि का उपयोग वायरस गुहा19के भीतर अतिरिक्त प्रोटीन घनत्व का पता लगाने के लिए किया जाता है ।
सिंगल विरेशन सुपर रेजोल्यूशन इमेजिंग:
एलेक्सा 647 लेबल VSV-G एंटीबॉडी विधि 5A का उपयोग कर सुपर संकल्प प्रयोगों के लिए व्यक्तिगत VSV virions के लिफाफे कोट करने के लिए इस्तेमाल किया गया। टेदरिंग घनत्व और कम अविशिष्ट बाध्यकारी को प्रदर्शित करने के लिए, नमूना का एक बड़ा स्कैन चित्र 2 एमें दिखाया गया है। एक प्रतिनिधि वीर पर वायरल लिफाफे की वसूली चित्रा 2B (ब्लू isosurface) में दिखाया गया है ।
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
चित्रा 1. कार्यात्मक पेग सतह पर मोतियों और वीएसवी की एएफएम इमेजिंग। 36 एनएम बायोटिनाइलेटेड मोतियों(ए, बी)और एक वीएसवी विरयन(सी)का एएफएम स्कैन एक बायोटिनेलेटेड वीएसवीजी एंटीबॉडी के साथ सतह पर लंगर डाले। एएफएम एसी एयर स्थलाकृति स्कैन मोड में किया गया। टिप त्रिज्या <25 एनएम है और माप बल मॉड्यूलेशन और प्रकाश दोहन के तहत किया गया। टिप में 15 किलोहर्ट्ज की अनिश्चितता के साथ 3 एन/एम और गूंजती आवृत्ति 75 किलोहर्ट्ज का बल स्थिर था। जबकि मोतियों ने एएफएम स्कैन के दौरान अपनी ऊंचाई को बनाए रखा, वीएसवी विरयन में काफी छोटे युवा के मॉड्यूलस होते हैं और ऊंचाई में काफी विकृत होते हैं। इस छवि में उग्र विशेष रूप से टैपिंग मोड में एक कठोर कैंटिलीवर के साथ चित्रित किया गया था जिसने एक छोटे से जाइल कन्वोल्वस (वायरस के टिप बनाम कुंद अंत को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है) और वायरस के टिप और कुंद अंत के बीच ऊंचाई अंतर का उपयोग वायरस19के कुंद अंत में अतिरिक्त प्रोटीन घनत्व का पता लगाने के लिए किया जाता है।
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> चित्रा 2। पेग कार्यात्मक सतह पर वीएसवी विरियंस की फ्लोरेसेंस आधारित इमेजिंग। ए)विस्तृत क्षेत्र फ्लोरेसेंस में इमेज्ड बायोटिनेलेटेड एंटी वीएसवीजी एंटीबॉडी का उपयोग करके पेग सतह पर पुनः संयोजन वीएसवी पौरस। B)उच्च संकल्प फ्लोरेसेंस एक बायोटिनाइलेटेड एंटी वीएसवीजी एंटीबॉडी के माध्यम से पेग सतह से जुड़े वीएसवी के लिफाफे का पुनर्निर्माण और एलेक्सा 647 लेबल एंटी-वीएसवीजी एंटीबॉडी (विधि 5A इन छवियों को बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था) के साथ सजाया गया था। नीली सतह एक 2D आइसोसुरफेस प्रक्षेपण है। बाएं गोली के आकार के वायरस का एक मॉडल दिखाता है । 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">कवरलिप आकार</td>
			<td style="width:93px;">सुपरिवर्तनीय</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 मिमी</td>
			<td>65 माइक्रोन</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 मिमी</td>
			<td>50 माइक्रोन</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 मिमी</td>
			<td>36 माइक्रोन</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 मिमी</td>
			<td>25 माइक्रोन</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 मिमी</td>
			<td>16 माइक्रोन</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1. कवरस्लिप आकार के अनुसार द्रव एलिकोट्स।

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Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

एकल वीरीय परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी

एक सतह के लिए virions के लगाव सुपर संकल्प फ्लोरेसेंस इमेजिंग या परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) द्वारा एकल वीर्य इमेजिंग के लिए एक आवश्यकता है । यहां हम एएफएम और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग में उपयोग के लिए उपयुक्त कांच की सतहों के लिए विरियंस के नियंत्रित आसंजन के लिए एक नमूना तैयारी विधि प्रदर्शित करते हैं।

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

SiRNA अभिकर्मक के बाद समय चूक सूत्रीविभाजन की इमेजिंग

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

माइक्रो यांत्रिक फेफड़े ऊतक का उपयोग परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी की विशेषता

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

बैक्टीरियल डिवीजन मशीनरी की सुपर संकल्प इमेजिंग

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

अनुकूलन तूफान सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए परीक्षण के नमूने

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

तेजी से विश्लेषण और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों का अन्वेषण

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

तीन आयामी सुपर Interferometric Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा एफ actin फिलामेंट्स के संकल्प माइक्रोस्कोपी (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper के साथ सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए ओपन-सोर्स एकल कण विश्लेषण

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में जमीन राज्य घट सुपर संकल्प इमेजिंग

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा Exosomes की नमूना तैयारी और इमेजिंग

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए लघुकृत नमूना तैयारी

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...