Name: sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Till Böcking pelo protocolo original de preparação de moléculas. 
Este trabalho foi apoiado pela bolsa NSF 1121972(SS).

1. Preparação química
<ol><li>Preparação e armazenamento de PLL-g-PEG-Biotin e avidin:<ol>
<li>Dissolva o polímero PLL-g-PEG-biotina no buffer PBS de acordo com as instruções do fabricante com uma concentração de 1,0 mg/ml.</li>
		<li>Alíquota de acordo com o tamanho do deslizamento de cobertura (ver Tabela 1) e armazenar a -80 °C por até um ano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação e armazenamento de Avidin/NeutrAvidin<ol>
<li>Dissolva o Avidin/NeutrAvidin não rotulado no buffer PBS de acordo com as instruções do fabricante com uma concentração de 1,0 mg/ml.</li>
		<li>Alíquota de acordo com o tamanho do deslizamento de cobertura (ver Tabela 1) e armazenar a -20 °C por até 3 anos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da amostra de vírus: Prepare amostras de vírus de acordo com a necessidade experimental e o protocolo de laboratório antes deste ensaio. Utilize a etapa 1.3.1 para o método 5A, ou 1.3.2 para o método 5B.<ol>
<li>Prepare amostras de vírus para o método 5A antes do estágio 2. Utilize amostras virais preparadas dentro de 1-2 dias após a preparação, ou alíquota de acordo com o tamanho do deslizamento de cobertura (ver Tabela 1) em seguida, o congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C por até um ano. Quando descongelar, use imediatamente.</li>
		<li>Prepare amostras de vírus para o método 5B semelhante ao 1.3.1. Descongele as alíquotas do vírus antes do 5B e armazene a 4 °C não mais do que 24 horas antes de misturar com anticorpos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare anticorpos biotinilados apropriados para o experimento.</li>
</ol>2. Limpeza de deslizamento de cobertura em preparação para tratamento químico
<ol><li>Coloque as tampas em um rack de talo teflon de tamanho apropriado que os mantém em uma orientação vertical e submerge-os em um béquer cheio de álcool etílico filtrado (0,2 μm) (prova de 190).</li>
	<li>Sonicate as tampas no álcool etílico filtrado (190 à prova) por 30 min.</li>
	<li>Remova as manchas de álcool e enxágue extensivamente com água ultrauso.</li>
	<li>Coloque as tampas enxaguadas em um rack Teflon limpo separado e béquer preenchido com 1 M NaOH.</li>
	<li>Sonicate as tampas no 1 M NaOH por 30 min.</li>
	<li>Remova as tampas do NaOH e enxágue-as extensivamente com água ultrauso.</li>
	<li>Seque as tampas enxaguadas com um fluxo de nitrogênio e coloque-as em um rack de Teflon limpo e seco.</li>
	<li>Inspecione as tampas para obter qualquer filme visível ou partículas que permaneçam na mancha de cobertura. Se algum material visível permanecer, a mancha não foi adequadamente limpa e enxaguada. Se não estiver devidamente limpo, repita as etapas 2.1-2.7.</li>
	<li>Limpe as tampas com oxigênio-plasma por 2 minutos. Esta etapa é opcional, mas recomendada.</li>
</ol>3. Formação da camada de filme fino PLL-g-PEG
<ol><li>Imediatamente após a secagem no fluxo de nitrogênio (ou o oxigênio-plasma opcional), coloque uma tampa horizontalmente em uma placa de Petri estéril. Pipet no centro da tampa uma quantidade apropriada de PBS tamponada tamponada PLL-g-PEG-biotina (ver Tabela 1).</li>
	<li>Coloque outra mancha de cobertura limpa em cima do fluido em um método de sanduíche. Observe que este método consiste em ter dois coverlips incubando seus filmes químicos orientando seus "rostos ativos" tratados quimicamente uns aos outros, separados apenas pela camada química atual. Certifique-se de que há fluido suficiente para que o volume entre as duas tampas esteja completamente preenchido com fluido, mas que nenhum fluido vaze entre as tampas (ver Tabela 1). O "rosto ativo" a partir de agora designa rostos de deslizamento que estiveram em contato com o fluido na configuração do sanduíche.</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 45-60 min.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e pegue o sanduíche com um par de pinças. Tenha cuidado para não beliscar o excesso de fluido. Use o polegar e o dedo indicador para beliscar o sanduíche levemente e deslize as tampas em direções opostas horizontalmente em relação uma à outra, em seguida, separe as duas tampas uma da outra sem tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com água ultrauso, canalando 25 ml de água ultrauso sobre a face ativa 2-4x, e depois seque as tampas com um fluxo de nitrogênio. Certifique-se de observar quais rostos de deslizamento de cobertura estão ativos.</li>
	<li>Utilize as tampas imediatamente, ou armazene O/N com o rosto ativo em uma placa de Petri estéril colocada em um ambiente de baixa umidade livre de poeira.</li>
</ol>4. Aprimoramento da ligação avidin
<ol><li>Coloque um deslizamento de cobertura tratado PLL-g-PEG com rosto ativo em uma placa de Petri estéril.</li>
	<li>Pipeta uma quantidade apropriada de avidin descongelado no buffer (preparado na etapa 1.2) para o meio da face ativa.</li>
	<li>Coloque outra mancha (face ativa para baixo) em cima do fluido no método do sanduíche. Observe a face ativa das tampas. É importante que as faces ativas estejam em contato com o fluido durante a incubação (ver passo 3.2).</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 25-30 min.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e separe as duas tampas conforme descrito na etapa 3.4, certificando-se de acompanhar e não tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com água ultrauso, canalando 25 ml de água ultrauso sobre a face ativa 2-4x e, em seguida, seque as tampas com um fluxo de nitrogênio. Observe a face ativa das tampas. Use imediatamente para a próxima etapa.</li>
</ol>NOTA IMPORTANTE: Existem dois métodos distintos para completar a preparação da amostra, dependendo do tipo de ensaio que o experimento implica. O experimentador deve prosseguir com o estágio 5A no qual o vírus está ancorado no vidro antes que qualquer tratamento adicional de anticorpos necessário para imagens de super resolução seja adicionado. 5B descreve um método alternativo de rotular o vírus na solução antes de ancorá-lo ao vidro. Os dados representativos deste manuscrito são preparados utilizando 5A. Um método apropriado deve ser selecionado de acordo com o tipo de ensaio experimental.
5A. Face Active Face Tether
<ol><li>Imediatamente após a secagem com um fluxo de nitrogênio no estágio 4.6, coloque uma tampa tratada de avidin face ativa em uma placa de Petri estéril.</li>
	<li>Pipeta uma quantidade apropriada de anticorpo biotinilado descongelado no tampão no meio da face ativa (ver Tabela 1).</li>
	<li>Coloque outra mancha (face ativa para baixo) em cima do fluido em um método de sanduíche. Note a face ativa das tampas, é importante que as faces ativas estejam em contato com o fluido para incubação (ver passo 3.2.).</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 45-60 min.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e separe as duas tampas conforme descrito na etapa 3.4, certificando-se de acompanhar e não tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com PBS ao pipetar 25 ml de PBS sobre a face ativa 2-4x, não secar e usar imediatamente. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Coloque um anticorpo tratado de capa ativa face em uma placa de Petri estéril, e pipeta uma quantidade apropriada de vírus descongelado no buffer no meio da face ativa.</li>
	<li>Coloque outra mancha (face ativa para baixo) em cima do fluido em um método de sanduíche. Observe a face ativa, pois é importante que as faces ativas estejam em contato com o fluido para incubação (ver passo 3.2.).</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 45-60 min.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e separe as duas tampas conforme descrito na etapa 3.4, certificando-se de acompanhar e não tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com PBS, tubulando 25 ml de PBS sobre a face ativa 2-4x. Não seque as tampas, em vez disso coloque-as em um rack de Teflon e béquer preenchido com PBS imediatamente. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Utilize as amostras preparadas imediatamente ou armazene em um buffer apropriado a 4 °C por até três dias sem perda significativa de integridade. NOTA IMPORTANTE: Se as amostras forem usadas em um ensaio AFM, a preparação estará completa e poderá ser utilizada imediatamente ou armazenada conforme descrito na etapa 5A.20 - 5A.21. Se as amostras forem utilizadas em um ensaio de imagem de fluorescência de super resolução, proceda à rotulagem de anticorpos descritas nas etapas 5A.12 - 5A.19.</li>
	<li>Coloque ambas as tampas tratadas pelo vírus face active face em uma placa de Petri estéril e tampão de bloqueio de proteína suficiente nas tampas para obter volume de fluido suficiente para cobrir os 95% centrais do deslizamento de cobertura sem fluir qualquer tampão de bloqueio fora da tampa (tipicamente 100 - 200 μl.) Incubar na RT por 60-90 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o tampão de bloqueio removendo as tampas uma de cada vez da placa de Petri e despejando o fluido da tampa em um béquer de resíduo. Tenha cuidado para não deixar cair o deslizamento.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com PBS ao pipetar 25 ml de PBS sobre a face ativa 2-4x, não secar e usar imediatamente. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Coloque um único tampão de bloqueio tratado de capa ativa em uma placa de Petri estéril, e pipeta uma quantidade apropriada de anticorpo viral fluorescente rotulado no buffer no meio do rosto ativo.</li>
	<li>Coloque outra mancha (face ativa para baixo) em cima do fluido em um método de sanduíche. Note qual rosto está ativo, é importante que as faces ativas estejam em contato com o fluido para incubação (ver passo 3.2).</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 30 minutos.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e separe as duas tampas conforme descrito na etapa 3.4, certificando-se de acompanhar e não tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com PBS ao pipetar 25 ml de PBS sobre a face ativa 2-4x, não secar e usar imediatamente. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Não seque as tampas, em vez disso coloque-as em um rack de Teflon dentro de um béquer cheio de PBS. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Utilize as amostras preparadas imediatamente ou armazene em um buffer apropriado a 4 °C por até três dias sem perda significativa de integridade.</li>
</ol>5B. Em Ataque de anticorpos de solução
Este método é um aprimoramento opcional da estratégia de rotulagem para a imagem fluorescente de super-resolução. Aplicando o ataque em solução, um melhor revestimento de anticorpos na superfície viral pode ser alcançado.
<ol><li>Misture soluções de anticorpos em proporções de acordo com a necessidade de experimentos. Exemplo 1:4 proporção de 0,01 mg/ml anticorpo biotinilado para 0,01 mg/ml anticorpo fluorescente rotulado dará uma boa afinidade de ligação e permitirá uma boa recuperação de envelope em um ensaio de imagem de super-resolução.</li>
	<li>Misture porções iguais das soluções de anticorpos e vírus, respectivamente, preparadas em (5B.1) e (1.3). Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo algumas vezes na alíquota. Esta solução resultante pode ser armazenada até que seja necessária por até 24 horas a 4 °C.</li>
	<li>Após a conclusão da etapa 4.6, coloque um talo tratado avidin com rosto ativo em uma placa de Petri estéril.</li>
	<li>Pipeta uma quantidade apropriada de vírus com solução de anticorpos (preparada na etapa 5B.2) no meio da face ativa.</li>
	<li>Coloque outra mancha (face ativa para baixo) em cima do fluido em um método de sanduíche. Observe a face ativa, pois é importante que as faces ativas estejam em contato com o fluido para incubação (ver passo 3.2).</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 45-60 min.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e separe as duas tampas conforme descrito na etapa 3.4, certificando-se de acompanhar e não tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com PBS, tubulando 25 ml de PBS sobre a face ativa 2-4x. Não seque as tampas, em vez disso coloque-as em um rack de Teflon e béquer preenchido com PBS imediatamente. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Utilize amostras preparadas imediatamente ou armazene a 4 °C por até três dias sem perda significativa de integridade.</li>
</ol>6. Medição da propriedade do material de microscopia da força atômica
<ol><li>Ligue os lasers AFM e abra o software AFM. Selecione o modo de varredura apropriado para o ensaio desejado a partir da caixa de diálogo de abertura. Todas as janelas necessárias devem ser abertas por padrão; se não consultar o manual do usuário para abrir as janelas desejadas.</li>
	<li>Selecione uma cantilever apropriada à medição desejada e insira-a na carcaça cantilever de acordo com as diretrizes do fabricante. Existem uma ampla gama de condições e tipos de experimentos para os quais há uma variedade de cantilevers. O experimentador deve pesquisar cantilevers de acordo com sua necessidade.</li>
	<li>Insira a carcaça cantilever na cabeça AFM de acordo com as diretrizes do fabricante.</li>
	<li>Se a amostra for usada em condições úmidas, remova a amostra do buffer de armazenamento e prossiga para a etapa 6.7.</li>
	<li>Se a amostra for usada em condições ambientais (secas), remova a amostra do seu tampão de armazenamento e enxágue-a brevemente mergulhando em um béquer de água ultrauso. Nota: Isso deixará uma fina camada de hidratação na amostra que pode induzir atração capilar com cantilevers tendo uma baixa constante de mola.</li>
	<li>Se a amostra for utilizada em condições ambientais (secas), seque suavemente a amostra com um fluxo de nitrogênio.</li>
	<li>Seque suavemente a parte de trás da tampa com um papel filtro sem poeira, certificando-se de não tocar na face ativa da amostra.</li>
	<li>Coloque a amostra no suporte de amostra AFM apropriado e coloque a amostra no estágio AFM.</li>
	<li>Se a amostra for imageada em condições úmidas, pipeta uma pequena quantidade de tampão no centro da amostra (~10 μl).</li>
	<li>Coloque a cabeça AFM sobre a amostra.</li>
	<li>Se a amostra estiver molhada, certifique-se de que a ponta cantilever e AFM penetrem na camada superficial, e que não haja bolhas entre a carcaça cantilever e cantilever.</li>
	<li>Alinhe o laser AFM com o cantilever de acordo com as recomendações do fabricante, a fim de obter o sinal ideal.</li>
	<li>Meça a frequência ressonante cantilever e defina a frequência de varredura de acordo com o tipo de experimento.</li>
	<li>Abaixe a ponta AFM para a superfície e otimize as configurações do sinal.</li>
	<li>Realize uma varredura AFM quadrada de 20 μm no modo de sua escolha. O modo Tapping (AC) foi utilizado na geração de dados representativos. Identifique os candidatos ao vírus por altura aproximada, que normalmente pode ser vista como picos afiados na superfície do vidro.</li>
	<li>Selecione um candidato a vírus e centralize a cabeça de varredura acima dele.</li>
	<li>Realize uma varredura quadrada de 250 nm (ou varredura de super-resolução apropriada) sobre o vírus selecionado, a fim de obter sua topologia e orientação.</li>
	<li>Selecione um ponto sobre o vírus para a medição da propriedade do material (por exemplo, o centro de um vírus esférico para uma medição de módulo de Young) e realize a medição de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>7. Método de imagem de super-resolução
<ol><li>Abra o software de imagem de super resolução e calibra o software de acordo com as diretrizes do fabricante.</li>
	<li>Calibrar o equipamento de imagem de super resolução de acordo com as instruções do fabricante utilizando contas fluorescentes.</li>
	<li>Monte o buffer de imagem amostral a partir de estoques pouco antes da imagem, combinando 50 μl de 1 M MEA e 100 μl de Gloxy de 10x a 850 μl de buffer de estoque. Mantenha o tampão de imagem no gelo durante o experimento.</li>
	<li>Remova uma mancha de cobertura preparada com amostra de seu buffer de armazenamento e enxágüe-o 5x mergulhando-o em um béquer de água ultrapura.</li>
	<li>Seque a face de deslizamento não ativo utilizando um papel filtro sem poeira. Certifique-se de não tocar no rosto ativo.</li>
	<li>Insira em um suporte de amostra do sistema de imagem e adicione 250 μl de tampão de imagem ao suporte da amostra. É razoável trocar o tampão de imagem na amostra a cada 2 horas para manter resultados consistentes.</li>
	<li>Cubra o porta-amostras com parafilme para diminuir a interação atmosférica com o ambiente da sala.</li>
	<li>Coloque o suporte de amostra no equipamento de imagem para imagens.</li>
	<li>Leve a amostra ao foco utilizando as instruções do fabricante.</li>
	<li>Imagem a amostra de acordo com a técnica de super-resolução que está sendo empregada. Certifique-se de ajustar as condições de imagem para otimizar o sinal, diminuindo as ativações simultâneas de fluoroforos foto-comutadores. NOTA IMPORTANTE: As condições de imagem são dependentes da amostra e variam de acordo com a necessidade experimental. Um experimento típico utilizando alexa 647 eficientemente inicializado para seu estado escuro no buffer de imagem pode então ser ativado por foto através da aplicação de luz UV de 405 nm. As imagens são obtidas por um subconjunto esparso de moléculas Alexa 647 dentro de uma amostra densamente rotulada e localizando cada fluoróforo com uma precisão limitada principalmente pelo número de fótons coletados. Este procedimento é iterado repetidamente pelo software até que um número desejado de ciclos de aquisição tenha acontecido. O experimentador deve ter essa configuração correlacionada com cada fluoróforo na amostra tendo sido foto-branqueada.</li>
	<li>Quando a imagem estiver concluída, desligue o equipamento de imagem de acordo com as instruções do fabricante. O software pode ser deixado em aberto para análise de dados.</li>
	<li>A análise dos dados depende fortemente do experimento; no entanto, em todos os casos, identificar vírus pela sua largura total pela metade do máximo, o que é comparado com as dimensões conhecidas do vírus, certificando-se de levar em consideração o tamanho adicional dos rótulos fluorescentes.</li>
	<li>Para uma melhor visualização, visualize as amostras utilizando a opção de renderização Isosulfa ou a opção de renderização volumosa, ambas normalmente encontradas em software de imagem de superres resolução.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pang, H. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry.">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4 (2013).</li><li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus.">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+tip&#8211;sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid.">Minimizing tip&#8211;sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue.">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Hernando-P&#233;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Virology:+Direct+Measurement+of+Phage.">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li><li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus.">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Visnapuu, M. -. L., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+surfaces+in+single-molecule+bioscience.">The importance of surfaces in single-molecule bioscience.</a> Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).</li><li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales.">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li><li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Kinetics+of+&#955;+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder.">Single-Molecule Kinetics of &#955; Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li><li>B&#246;cking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating.">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li><li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit.">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li><li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+Spectrin,+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons.">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus.">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li></ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes neste artigo.

Imagens de virion única com imagens de fluorescência AFM e alta resolução podem ser usadas como uma metodologia alternativa à tomografia CryoEM. Cada uma dessas metodologias tem seus pontos fortes específicos. Por exemplo, afm pode ser feito em virions WT sem necessidade de marcar a amostra ou as proteínas virais internas. A localização das estruturas virais é desconvolvada de suas contribuições para as propriedades elásticas do virion.
Imagem de super-resolução de virion único em combinação com as abordagens genéticas reversas virais recém-desenvolvidas torna-se uma técnica poderosa para localização de proteínas virais de baixo número de cópia20. Vírus recombinantes com a substituição de suas proteínas por proteínas fundidas a proteínas fluorescentes podem ser feitos e purificados usando essas abordagens genéticas reversas. Embora a imagem de super resolução tenha especificidade em parte devido à marcação genética, requer o uso dos vírus mutantes.
AfM e imagens de superrespeição são métodos complementares que utilizam preparações amostrais muito semelhantes. Os métodos descritos neste artigo, que são adotados formam ensaios de imagem de molécula única anterior, permitem ancoragem de virions únicos com poucos efeitos na topologia dos virions.

Interações não específicas baseadas em carga são rotineiramente usadas para adesão de virions na microscopia de força atômica1,2. Essas técnicas funcionam especialmente bem quando usadas em virions não desenvolvidos com capsídeos muito rígidos3-6. Embora essas técnicas sejam muito eficazes na imobilização da amostra, elas não impedem a ligação inespecífica de proteínas à superfície. A ligação não específica pode criar um problema ao tentar imaginar virions com técnicas de fluorescência AFM e super-resolução que requerem incubações da amostra com vários anticorpos. Aqui descrevemos um método de preparação amostral para imobilização específica de virions.
Poli (etileno glicol) (PEG) enxertado em poli (L-lysine) (PLL) e adsorvido em uma superfície de vidro fornece um bloco significativo para as interações eletrostáticas de proteínas com vidro7. Ensaios de molécula única que requerem imobilização de moléculas únicas em superfícies de vidro aproveitaram esta propriedade e a usaram para criar uma técnica específica de imobilização de molécula única baseada em PEG8-10. Esta preparação também foi utilizada para imobilizar gaiolas de clathrin na superfície de vidro11, bem como criar um revestimento de fibronectina homogênea para a adesão celular de controle 12.
Adotamos o método de preparação da amostra baseado na adsorção PLL-g-PEG em superfícies de vidro a partir de metodologias de imagem de molécula única e aplicamos-na a imagens de virions únicos do vírus da estomatite vesicular (VSV). Estes virions únicos foram imagens usando microscopia de força atômica (AFM). Experimentos semelhantes também foram realizados em contas funcionais como controle. Os virions também foram imagens pela microscopia de fluorescência de super resolução foram um anticorpo VSV-G rotulado com Alexa 647 foi usado para criar uma imagem do envelope de virions únicos. A imagem fluorescente de alta resolução utiliza a localização de moléculas únicas para criar uma imagem13-15. a imagem bi-planar fPALM permite a localização de moléculas únicas com resolução de 20 nm em plano e 50 nm ao longo do eixo óptico15,16. Esta técnica bi-planar foi utilizada para imagens fluorescentes de super-resolução presentes neste estudo. Uma técnica alternativa que tem resultados semelhantes é a STORM13,17,18.
Tanto as imagens fluorescentes afm quanto super-resolução fluorescentes de VSV ancoradas no vidro pelos procedimentos descritos neste artigo, mostraram ligação específica de virions ao vidro com interações mínimas não específicas19. Aqui apresentamos os protocolos de preparação da amostra para os experimentos de imagem fluorescente de ultra-resolução e afm e super-resolução. Resumindo: As tampas de vidro limpas são funcionalizadas por adsorção de uma mistura de PLL-g-PEG e PLL-g-PEG-biotina. É típico que este filme fino seja projetado para fornecer entre 15-25% biotina funcionalizada em uma superfície revestida. As tampas são incubadas com avidin tetramérica. Um anticorpo viral biotinilado é então usado para criar um local de ligação único para os virions. A ligação do anticorpo pode ser feita de duas maneiras.
O primeiro método é otimizado para AFM, no entanto, permanece adequado para imagens de fluorescência de super-resolução. Neste método, a superfície revestida de avidin é tratada com anticorpo biotinilado antes da adesão viral. Os virions imobilizados são tratados com anticorpos rotulados Alexa 647 para cobrir o envelope e permitir imagens de fluorescência de super resolução dos virions.
O segundo método é atacar o vírus em solução com o anticorpo biotiningado e o anticorpo alexa 647 rotulado antes de aderir aos vírus à superfície tratada avidin; este método é otimizado para experimentos de imagem de fluorescência de super resolução em que a recuperação do envelope viral é importante. Este método tem a vantagem de permitir o revestimento uniforme de anticorpos na superfície viral. O anticorpo biotiningado pode ser misturado com anticorpos virais rotulados alexa 647 em proporções que permitem adsorção suficiente do vírus para a superfície tratada avidin, mantendo uma alta concentração de rótulo fluorescente no exterior do envelope viral. Estes anticorpos virais rotulados alexa 647 não são biotinilados e seu excesso pode ser lavado para reduzir o ruído de fundo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

A imobilização de virions em superfícies de vidro é um passo crítico na imagem de virion única. Aqui apresentamos uma técnica adotada a partir de ensaios de imagem de molécula única que permite a adesão de virions únicos a superfícies de vidro com especificidade. Esta preparação baseia-se no enxerto da superfície do vidro com uma mistura de PLL-g-PEG e PLL-g-PEG-Biotina, adicionando uma camada de avidin, e finalmente criando âncoras de virion através da fixação de anticorpos específicos do vírus biotinilado. Aplicamos essa técnica em uma série de experimentos, incluindo microscopia de força atômica (AFM) e imagens de fluorescência de super-resolução. Este método de preparação da amostra resulta em uma adesão de controle dos virions à superfície.

Imagem de virion única usando AFM:
O protocolo de preparação da amostra descrito acima foi utilizado na ancoragem de virions tipo selvagem à superfície do vidro. Os virions VSV têm forma de bala de 180 nm de comprimento e 80 nm de diâmetro. Como há uma variedade de virions para os quais essa técnica pode ser aplicada, o conceito também é demonstrado aqui em contas biotinylated de 36 nm também. Os experimentos AFM resultantes são mostrados na Figura 1. É importante notar que os virions VSV têm um módulo de Young mais baixo (100 MPa) em comparação com os vírus não desenvolvidos (GPa). As imagens particulares de single virion VSV foram obtidas no modo de toque em condições ambientais com um cantilever rígido. O objetivo tem sido deformar o vírus a ponto de que a densidade proteica extra dentro do vírus se torne visível como um galo dentro da imagem AFM. Este método é usado para detectar a densidade proteica extra dentro da cavidade do vírus19.
Imagem de super resolução de virion único:
Os anticorpos VSV-G rotulados alexa 647 foram usados para revestir o envelope de virions VSV individuais para experimentos de super-resolução usando o método 5A. Para demonstrar a densidade de amarração e a baixa ligação inespecífica, uma grande varredura da amostra é mostrada na Figura 2A. A recuperação do envelope viral em um virion representativo é mostrada na Figura 2B (isosuperfície azul).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Figura 1. Imagens AFM de contas e VSV na superfície PEGG funcionalizada. AfM scan de 36 nm contas biotiniladas(A, B) e uma virion VSV(C)ancorada na superfície com um anticorpo VSVG biotinilado. A AFM foi feita no modo de topografia de ar CA. O raio da ponta é <25 nm e as medições foram realizadas sob modulação de força e toque de luz. A ponta tinha uma constante de força de 3 N/m e frequência ressonante de 75 kHz com incerteza de 15 kHz. Enquanto as contas mantiveram sua altura durante a varredura AFM, a virion VSV tem um módulo de jovem significativamente menor e é significativamente deformada em altura. Nesta imagem, a virion foi especificamente imagem com uma cantilever rígida no modo de toque que produziu uma pequena convolução de ximia (usada para determinar a ponta vs extremidade contundente do vírus) e a diferença de altura entre a ponta e a extremidade contundente do vírus é usada para detectar densidade proteica extra na extremidade bruta do vírus19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Figura 2. Imagens baseadas em fluorescência de virions VSV na superfície funcionalizada PEGG. A) virions VSV recombinantes imobilizados na superfície PEGG usando um anticorpo anti VSVG biotinína, visualizado em fluorescência de campo largo. B) Reconstrução de fluorescência de alta resolução do envelope de VSV anexado à superfície PEGG através de um anticorpo anti VSVG biotinitado e decorado com anticorpos anti-VSVG rotulados Alexa 647 (o método 5A foi usado para criar essas imagens). A superfície azul é uma projeção isosuperfície 2D. A esquerda mostra um modelo do vírus em forma de bala. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Tamanho do deslizamento de cobertura</td>
			<td style="width:93px;">fluido</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 1. Alíquotas fluidas de acordo com o tamanho do deslizamento de cobertura.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging at JoVE.com

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

A fixação de virions a uma superfície é um requisito para imagens de virion única por imagens de fluorescência de super resolução ou microscopia de força atômica (AFM). Aqui demonstramos um método de preparação de amostras para adesão controlada de virions a superfícies de vidro adequadas para uso em AFM e imagens de fluorescência de super resolução.

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologia

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...