Name: sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00
Duration: 5 min 31 s
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Agradecemos al Dr. Till Böcking por el protocolo original de preparación de una sola molécula. 
Este trabajo fue apoyado por la subvención NSF 1121972(SS).

<ol>
	<li>Pang, H. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry.">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4 (2013).</li><li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus.">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. 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Rep. 3, (2013).</li><li>Hernando-P&#233;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Virology:+Direct+Measurement+of+Phage.">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li><li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus.">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales.">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li><li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Kinetics+of+&#955;+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder.">Single-Molecule Kinetics of &#955; Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li><li>B&#246;cking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating.">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li><li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit.">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li><li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+Spectrin,+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons.">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus.">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos en este trabajo.

La proyección de imagen del solo virión con AFM y proyección de imagen de alta resolución de la fluorescencia se puede utilizar como metodología alternativa a la tomografía de CryoEM. Cada una de estas metodologías tiene sus fortalezas específicas. Por ejemplo, AFM se puede hacer en viriones WT sin necesidad de etiquetar la muestra o las proteínas virales internas. La localización de las estructuras virales se desconvía de sus contribuciones a las propiedades elásticas del virión.
Las imágenes de super-resolución de virión único en combinación con los enfoques genéticos inversos virales recientemente desarrollados se convierten en una técnica poderosa para localizar proteínas virales de bajo número de copias20. Los virus recombinantes con el reemplazo de sus proteínas con las proteínas fundidas a las proteínas fluorescentes se pueden hacer y purificar usando estos acercamientos genéticos reversos. Aunque las imágenes de súper resolución tienen especificidad en parte debido al etiquetado genético, requiere el uso de los virus mutantes.
AFM y la proyección de imagen de la super-resolución son los métodos complementarios que utilizan preparaciones muy similares de la muestra. Los métodos descritos en este documento, que se adoptan forman ensayos anteriores de imágenes de molécula única, permiten el anclaje de viriones individuales con pocos efectos sobre la topología de los viriones.

Las interacciones inespecíficas basadas en la carga se utilizan rutinariamente para la adhesión de viriones en microscopía de fuerza atómica1,2. Estas técnicas funcionan especialmente bien cuando se utilizan en viriones no enredados con cápsides muy rígidas3-6. Aunque estas técnicas son muy eficaces en la inmovilización de la muestra, no evitan la unión inespecífica de proteínas a la superficie. La unión inespecífica puede crear un problema al intentar obtener imágenes de viriones con AFM y técnicas de fluorescencia de súper resolución que requieren incubaciones de la muestra con varios anticuerpos. Aquí se describe un método de preparación de la muestra para la inmovilización específica de viriones.
Poli(etilenglicol) (PEG) injertado a poli(L-lisina) (PLL) y adsorbido sobre una superficie de vidrio proporciona un bloque significativo para las interacciones electrostáticas de proteínas con vidrio7. Los ensayos de moléculas individuales que requieren inmovilización de moléculas individuales en superficies de vidrio han aprovechado esta propiedad y la han utilizado para crear una técnica específica de inmovilización de molécula única basada en PEG8-10. Esta preparación también se utilizó para inmovilizar jaulas de clatrina en la superficie de vidrio11, así como para crear un recubrimiento homogéneo de fibronectina para el control de la adhesión celular 12.
Hemos adoptado el método de la preparación de la muestra basado en la adsorción de PLL-g-PEG a las superficies de cristal de metodologías de la proyección de imagen de una sola molécula y lo hemos aplicado a los solos viriones de la proyección de imagen del virus vesicular de la estomatitis (VSV). Estos viriones individuales fueron fotomicadas usando la microscopia de la fuerza atómica (AFM). También se realizaron experimentos similares en perlas funcionalizadas como control. Los viriones también fueron foto fotomicadas por microscopía de fluorescencia de súper resolución si se utilizó un anticuerpo VSV-G etiquetado con Alexa 647 para crear una imagen de la envoltura de viriones individuales. Imágenes fluorescentes de alta resolución utiliza la localización de moléculas individuales para crear una imagen13-15. La imagen biplanar de fPALM permite la localización de moléculas individuales con 20 nm en plano y 50 nm de resolución a lo largo del eje óptico15,16. Esta técnica bi-planar fue utilizada para las imágenes fluorescentes de la super-resolución de la imagen presentes en este estudio. Una técnica alternativa que tiene resultados similares es STORM13,17,18.
Tanto AFM como imágenes fluorescentes de súper resolución de VSV ancladas al vidrio por los procedimientos descritos en este trabajo, mostraron una unión específica de viriones al vidrio con mínimas interacciones inespecíficas19. Aquí presentamos los protocolos de preparación de muestras para el AFM y experimentos de imágenes fluorescentes de súper resolución. En resumen: Las tapas de vidrio limpio se funcionalizan mediante la adsorber una mezcla de PLL-g-PEG y PLL-g-PEG-biotina. Es típico que esta película delgada esté diseñada para proporcionar entre un 15-25% de biotina funcionalizada en una superficie recubierta. Los cubrebocas se incuban además con avidina tetramérica. Un anticuerpo viral biotinilado entonces se utiliza para crear un sitio de unión único para los viriones. La unión del anticuerpo se puede hacer de dos maneras.
El primer método está optimizado para AFM, sin embargo, sigue siendo adecuado para imágenes de fluorescencia de súper resolución. En este método la superficie recubierta de avidina se trata con anticuerpos biotinilados antes de la adhesión viral. Los viriones inmovilizados se tratan con el anticuerpo etiquetado Alexa 647 para cubrir la envoltura y permitir imágenes de fluorescencia de súper resolución de los viriones.
El segundo método es atacar el virus en solución con el anticuerpo biotinilado y el anticuerpo etiquetado alexa 647 antes de adherir los virus a la superficie tratada con avidina; este método está optimizado para experimentos de imágenes de fluorescencia de súper resolución en los que la recuperación de la envoltura viral es importante. Este método tiene la ventaja de permitir un recubrimiento uniforme de anticuerpos en la superficie viral. El anticuerpo biotinilado se puede mezclar con anticuerpos virales etiquetados alexa 647 en proporciones que permiten suficiente adsorción del virus a la superficie tratada con avidina mientras se mantiene una alta concentración de etiqueta fluorescente en el exterior de la envoltura viral. Estos anticuerpos virales etiquetados con Alexa 647 no están biotinilados y su exceso puede enjuagarse para reducir el ruido de fondo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

La inmovilización de viriones a superficies de vidrio es un paso crítico en la proyección de imagen de un solo virión. Aquí presentamos una técnica adoptada de ensayos de imágenes de una sola molécula que permite la adhesión de viriones individuales a superficies de vidrio con especificidad. Esta preparación se basa en injertar la superficie del vidrio con una mezcla de PLL-g-PEG y PLL-g-PEG-Biotina, añadir una capa de avidina, y finalmente crear anclajes de virión a través de la unión de anticuerpos específicos del virus biotinilado. Hemos aplicado esta técnica a través de una gama de experimentos incluyendo la microscopia de la fuerza atómica (AFM) y la proyección de imagen de la fluorescencia de la super-resolución. Este método de preparación de la muestra da como resultado una adhesión de control de los viriones a la superficie.

Imágenes de virión único usando AFM:
El protocolo de preparación de muestras descrito anteriormente se utilizó en el anclaje de viriones de tipo salvaje a la superficie de vidrio. Los viriones VSV tienen forma de bala de 180 nm de longitud y 80 nm de diámetro. Como hay una variedad de viriones para los que se puede aplicar esta técnica, el concepto también se demuestra aquí en perlas biotiniladas de 36 nm también. Los experimentos AFM resultantes se muestran en la Figura 1. Es importante tener en cuenta que los viriones VSV tienen un módulo de Young más bajo (100 MPa) en comparación con los virus no envopados (GPa). Las imágenes particulares de un solo virión VSV se obtuvieron en modo de tapping en condiciones ambientales con un voladizo rígido. El objetivo ha sido deformar el virus hasta el punto de que la densidad de proteínas adicionales dentro del virus se hace visible como una protuberancia dentro de la imagen AFM. Este método se utiliza para detectar la densidad extra de proteínas dentro de la cavidad del virus19.
Imágenes de super resolución de virión único:
Alexa 647 etiquetado VSV-G anticuerpos se utilizaron para recubrir la envoltura de viriones VSV individuales para experimentos de súper resolución utilizando el método 5A. Para demostrar la densidad de ataduras y la baja unión inespecífica, se muestra un escaneo grande de la muestra en la Figura 2A. La recuperación de la envoltura viral en un virión representativo se muestra en la Figura 2B (isosuperficie azul).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Figura 1. Proyección de imagen de AFM de cuentas y de VSV en la superficie funcionalizada de PEGG. Exploración de AFM de los granos biotinylated de 36 nanómetro(A, B)y de un virion de VSV(c)anclado a la superficie con un anticuerpo biotinylated de VSVG. AFM se realizó en modo de exploración de topografía de aire ac. El radio de la punta es de <25 nm y las mediciones se llevaron a cabo bajo modulación de fuerza y golpecito de luz. La punta tenía una constante de fuerza de 3 N/m y una frecuencia resonante de 75 kHz con una incertidumbre de 15 kHz. Mientras que las perlas conservaron su altura durante la exploración AFM, el virión VSV tiene un módulo de jóvenes significativamente más pequeño y está significativamente deformado en altura. En esta imagen, el virión fue fotoficado específicamente con un voladizo rígido en modo tapping que produjo una pequeña convolución xy (utilizada para determinar la punta vs extremo romo del virus) y la diferencia de altura entre la punta y el extremo romo del virus se utiliza para detectar densidad de proteínas adicionales en el extremo romo del virus19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Figura 2. Fluorescencia basada en imágenes de viriones VSV en la superficie funcionalizada PEGG. A)viriones recombinantes de VSV inmovilizados en la superficie de PEGG utilizando un anticuerpo anti VSVG biotinilado fotoizado en fluorescencia de amplio campo. B)Reconstrucción de fluorescencia de alta resolución de la envoltura de VSV unida a la superficie de PEGG a través de un anticuerpo anti VSVG biotinilado y decorado con anticuerpos anti-VSVG etiquetados con Alexa 647 (se utilizó el Método 5A para la creación de estas imágenes). La superficie azul es una proyección isosuperficial 2D. La izquierda muestra un modelo del virus en forma de bala. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Tamaño de la la ficha de cubierta</td>
			<td style="width:93px;">fluido</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 milímetros</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 milímetros</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 milímetros</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 milímetros</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 milímetros</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Alícuotas fluidas según el tamaño del cubrecubos.

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Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

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